siRNA沉默Ikaros基因?qū)562細(xì)胞中γ珠蛋白表達(dá)的影響＊

馬 艷 李 冉 吳新忠，＃ 胡 珺 曾 玉

地中海貧血，即β珠蛋白合成障礙性貧血，簡(jiǎn)稱地貧，是一種單基因缺陷的遺傳性疾病，它是由于β珠蛋白多肽鏈合成減少或缺失，α鏈與非α鏈（β、γ、δ）之間不平衡所導(dǎo)致的以紅細(xì)胞無(wú)效生成為特征的血紅蛋白病。重型β－地貧常常有嚴(yán)重的臨床癥狀，多采取規(guī)則的輸血及祛鐵治療，但大多數(shù)病人最終還是死于鐵過(guò)載相關(guān)的心臟疾病，平均壽命不滿20歲［1］。有研究表明，合并遺傳性胎兒血紅蛋白（HbF，α2γ2）持續(xù)存在綜合癥（HPFH）的β－地貧患者，由于γ珠蛋白和α珠蛋白基因的較平衡表達(dá)，比單純?chǔ)拢刎毣颊吲R床癥狀明顯減輕，只有輕微貧血，且不需要輸血治療［2］。因而增加γ珠蛋白肽鏈的合成，使γ珠蛋白鏈結(jié)合過(guò)剩的α珠蛋白鏈，糾正α與非α鏈的不平衡，減輕重型β－地貧患者臨床癥狀，已被認(rèn)為是治療重型β－地貧的一種有效方法［3］。然而，γ珠蛋白基因具有發(fā)育階段特異性，僅在胎兒期高表達(dá)，正常成人的表達(dá)量不到其1%，其原因之一是轉(zhuǎn)錄因子Ikaros抑制了γ珠蛋白基因表達(dá)。因此，本文通過(guò)設(shè)計(jì)siRNA序列及優(yōu)化干擾條件，特異性沉默Ikaros基因，誘導(dǎo)γ珠蛋白表達(dá)增加，從而為重型β－地貧的基因治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑：K562細(xì)胞由廣東省中醫(yī)院周華友博士惠贈(zèng)；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；丁酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；γ珠蛋白一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；RT－PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，Real－time定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioRad公司；NC膜購(gòu)自美國(guó) Whatman公司，羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的陰性siRNA和siRNA－Ikaros由上海吉瑪公司合成；Ikaros、γ珠蛋白、GAPDH、β－actin引物均由Invitrogen公司廣州分公司合成。

1.1.2 主要儀器：Cytomics FC500流式細(xì)胞儀（美國(guó)），BioRad凝膠成像儀（美國(guó)），Prism 7500ABI Real－time定量PCR儀（美國(guó)），Prism 9700ABI半定量 RT－PCR儀（美國(guó)）。

1.2 siRNA序列及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)選

1.2.1 siRNA寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)：檢索NCBI GenBank，查找Ikaros基因序列（NM＿006060.3），參照siRNA設(shè)計(jì)原則，利用Invitrogen公司在線軟件，設(shè)計(jì)3條特異性siRNA寡核苷酸序列，分別為siRNA1、siRNA2和siRNA3。siRNA1正義鏈5′－GUU AAA GUA GAG ACU CAG ATT－3′，反義鏈5′－UCU GAG UCU CUA CUU UAA CTT－3′；siRNA2 正 義 鏈 5′－GGA GGC AUU CGA CUU CCU ATT－3′，反 義 鏈 5′－UAG GAA GUC GAA UGC CUC CTT－3′；siRNA3正義鏈5′－GAC GCA CUC CGU UGG UAA ATT－3′，反義鏈 5′－UUU ACC AAC GGA GUG CGU CTT－3′。同時(shí)選取一對(duì)與Ikaros完全無(wú)同源性的siRNA寡核苷酸序列siRNA mock作為陰性對(duì)照，其正義鏈5′－UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT－3′，反 義鏈 5′－ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT－3′。

1.2.2 siRNA 轉(zhuǎn)染：（1）K562細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：K562細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，2～3天傳代一次，共傳代6次，傳代時(shí)用0.25%的胰蛋白酶（含0.1%EDTA）進(jìn)行消化。1 000r／min，離心5min，棄上清，將細(xì)胞打散，用1×PBS洗兩遍，加入適量上述培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，輕輕吹打均勻，計(jì)數(shù)后用上述培養(yǎng)液調(diào)整其終濃度為3.0×106個(gè)／ml左右。（2）siRNA轉(zhuǎn)染：將含F(xiàn)AM熒光基團(tuán)的陰性siRNA與Lipofectamine 2000按不同體積比（3.75∶1、3.75∶2、2∶2、1∶2、0.5∶2）混合后分別轉(zhuǎn)染入穩(wěn)定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，總體積為500μl，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 RT－PCR檢測(cè)siRNA1～3的干擾效率：（1）siRNA1～3對(duì)Ikaros mRNA表達(dá)的抑制作用：取處于穩(wěn)定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別用siRNA1、siRNA2、siRNA3轉(zhuǎn)染，同時(shí)以未經(jīng)任何處理的K562細(xì)胞作為空白組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。72h后分別收集K562細(xì)胞，用冷PBS清洗后采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，以T重復(fù)寡核苷酸（Oligo－DT）為引物將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Ikaros基因的擴(kuò)增引物：正義鏈5′－CGG CTT TGT CGG GAG TT－3′，反義鏈5′－GCA CAG GTC TTC TGC CAT TT－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為458bp；內(nèi)參選取GAPDH，其引物正義鏈5′－GGG GCC ATC CAC AGT CTT C－3′，反義鏈5′－CAC CAT CTT CCA GGA GCG AG－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物352bp。擴(kuò)增條件：94℃30s，53℃40s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射燈下觀察，凝膠成像儀拍照后用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。表達(dá)抑制率＝（1－轉(zhuǎn)染組Ikaros mRNA灰度比值／空白組Ikaros mRNA灰度比值）×100%。選擇抑制率最高的siRNA序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）siRNA的最佳干擾時(shí)間：選擇干擾效率最高的siRNA序列轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞后24h、48h、72h、96h、120h、144h分別收集細(xì)胞，采用RT－PCR方法檢測(cè)Ikaros的 mRNA水平，GAPDH為內(nèi)參，以Ikaros最低表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)確定為最佳干擾時(shí)間。

1.3 沉默實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置siRNA組、丁酸鈉組、丁酸鈉＋siRNA組、陰性對(duì)照組和siRNA空白組。以最佳siRNA序列作為siRNA組；丁酸鈉組是其單獨(dú)作用于K562細(xì)胞后γ珠蛋白表達(dá)增強(qiáng)的陽(yáng)性對(duì)照組，根據(jù)文獻(xiàn)［3］選擇0.5mmol／L濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；丁酸鈉＋siRNA組即將最佳siRNA＋0.5mmol／L丁酸鈉進(jìn)行雙重干預(yù)；陰性對(duì)照組為不具有沉默功能的siR－NA mock轉(zhuǎn)染組；空白組為不行任何干預(yù)的K562細(xì)胞。取穩(wěn)定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，經(jīng)離心、計(jì)數(shù)、鋪板后，按上述分組進(jìn)行處理，于已確定的最佳干擾時(shí)間收集各組細(xì)胞，每組均設(shè)3復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 Real－time定量PCR檢測(cè)Ikaros和γ珠蛋白mRNA的表達(dá)

按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取五組細(xì)胞的總RNA，采用Real－time定量PCR檢測(cè)Ikaros和γ珠蛋白mRNA的表達(dá)水平。Ikaros的引物和擴(kuò)增條件見(jiàn)1.2.3，γ珠蛋白PCR的引物序列和擴(kuò)增條件為：正義鏈5′－GTC CTC TGC CTC TGC CAT CA－3′，反義鏈5′－ATA CAG GGC ACT GGC CAC TC－3′，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4min，然后94℃1min，50℃30s，72℃40s，共28個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，擴(kuò)增產(chǎn)物283bp。內(nèi)參選取β－actin，引物序列正義鏈5′－TGG CAC CCA GCA CAA TGA A－3′，反 義 鏈 5′－CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A－3，擴(kuò)增產(chǎn)物186bp。以β－actin作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行歸一化處理，以空白組細(xì)胞的mRNA水平作為基準(zhǔn)，分別對(duì)各組K562細(xì)胞的Ikaros和γ珠蛋白mRNA水平進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

1.5 Western blotting檢測(cè)γ珠蛋白表達(dá)水平

各組K562細(xì)胞加入蛋白抽提裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，冰浴15min，離心收集細(xì)胞總蛋白。蛋白提取物經(jīng)定量后，取25μg上樣至12%SDS－PAGE，電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)至NC膜。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后加入一抗（稀釋度1∶1 000），4℃平緩搖動(dòng)過(guò)夜。次日洗膜3次后，加入二抗（稀釋度1∶5 000），孵育，經(jīng)ECL顯色，顯影、定影成像后對(duì)膠片進(jìn)行灰度掃描。選取GAPDH作為內(nèi)參，以空白組灰度水平作為基準(zhǔn)，對(duì)各組K562細(xì)胞的γ珠蛋白水平進(jìn)行灰度比值分析。

1.6 聯(lián)苯胺染色檢測(cè)Hb水平

K562細(xì)胞內(nèi)Hb濃度用聯(lián)苯胺染色法進(jìn)行檢測(cè)。分別收集各組培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h、144h的K562細(xì)胞，制備成懸液。按文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行染色，胞漿呈淺綠色的K562細(xì)胞為聯(lián)苯胺染色陰性，藍(lán)色為染色陽(yáng)性。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.3統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用F檢驗(yàn)對(duì)各組進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，用LSD法進(jìn)行多組間兩兩比較；百分率（%）比較采用χ2分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA篩選結(jié)果

2.1.1 siRNA轉(zhuǎn)染效率及條件：含F(xiàn)AM熒光基團(tuán)的陰性siRNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后，24h、48h、72h分別收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h效率最高，達(dá)到58.7%，如圖1所示。轉(zhuǎn)染條件為：K562細(xì)胞用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24～72h后，用純RPMI 1640培養(yǎng)基重懸浮進(jìn)行轉(zhuǎn)染，siRNA與Lipofectamine 2000的比例為3.75∶2（μl），細(xì)胞懸液終體積為500μl。

圖1 含F(xiàn)AM熒光基團(tuán)的陰性siRNA轉(zhuǎn)染K562的流式細(xì)胞圖

2.1.2 不同序列siRNA對(duì)Ikaros mRNA表達(dá)的抑制作用比較：3條siRNA基因序列干擾K562細(xì)胞后Ikaros基因mRNA的表達(dá)情況如圖2所示，siRNA1、siRNA2和siRNA3三組與空白組之間的灰度比值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），siRNA1、siRNA2、siRNA3之間的灰度比值雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但siRNA3較siRNA1和siRNA2更低一些，其對(duì)Ikaros mRNA的表達(dá)抑制率最高，達(dá)到86.7%。因而后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用siRNA3為最佳干擾序列。

2.1.3 siRNA 的最佳干擾時(shí)間：結(jié)果顯示：siRNA3轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后24h，其Ikaros mRNA的表達(dá)量開(kāi)始減少，72h表達(dá)量最低，與空白組和陰性對(duì)照組之間有顯著差異（P＜0.05），96h～144h逐漸增加（圖3）。由此確定siRNA3的最佳干擾時(shí)間為轉(zhuǎn)染后72h。

2.2 siRNA3沉默Ikaros對(duì)K562細(xì)胞Ikaros mRNA的影響

圖2 3條siRNA基因序列干擾Ikaros mRNA表達(dá)的RT－PCR結(jié)果

圖3 siRNA3轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后Ikaros mRNA表達(dá)水平

siRNA3轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后72h，收集五組細(xì)胞，進(jìn)行 Real－time PCR。結(jié)果顯示，siRNA3、siRNA3＋丁酸鈉兩組Ikaros mRNA的相對(duì)表達(dá)量比丁酸鈉、陰性對(duì)照和空白組明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而siRNA3組和siRNA3＋丁酸鈉兩組之間，丁酸鈉、陰性對(duì)照和空白三組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 siRNA3沉默Ikaros基因?qū)562細(xì)胞Ikaros mRNA的影響

2.3 siRNA3沉默Ikaros對(duì)K562細(xì)胞γ珠蛋白mRNA的影響

Real－time PCR 結(jié)果 顯示，siRNA3、丁酸 鈉和siRNA3＋丁酸鈉三組γ珠蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照和空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；siRNA3、丁酸鈉和siRNA3＋丁酸鈉三組之間，以及陰性對(duì)照和空白組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 siRNA3沉默Ikaros基因?qū)562細(xì)胞γ珠蛋白mRNA的影響

2.4 siRNA3沉默Ikaros對(duì)K562細(xì)胞γ珠蛋白蛋白水平的影響

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA3、丁酸鈉和siRNA3＋丁酸鈉三組，γ珠蛋白表達(dá)量（以灰度比值表示）明顯高于陰性對(duì)照和空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；siRNA3、丁酸鈉和siRNA3＋丁酸鈉三組之間，以及空白與陰性對(duì)照組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 siRNA3沉默Ikaros基因?qū)562細(xì)胞γ珠蛋白蛋白水平的影響

2.5 siRNA3沉默Ikaros對(duì)K562細(xì)胞Hb水平的影響

圖7 siRNA3沉默Ikaros后K562細(xì)胞聯(lián)苯胺陽(yáng)性細(xì)胞率的變化

K562細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色為聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性，陽(yáng)性率越高，表示其Hb含量越高。siRNA3等沉默Ikaros后K562細(xì)胞聯(lián)苯胺陽(yáng)性細(xì)胞率的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖7。陰性對(duì)照和空白組的聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞率每天比較接近，平均4.77～5.44%；而siRNA3、丁酸鈉、siRNA3＋丁酸鈉三組的培養(yǎng)72h細(xì)胞聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性率均較高，分別為32.5%、31.3%和33.1%，與前兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三個(gè)處理組培養(yǎng)96h陽(yáng)性率與72h接近，之后逐漸降低。

3 討 論

嘧啶（PYR）復(fù)合物（因其DNA結(jié)合位點(diǎn)富含嘧啶堿基而得名）含有三個(gè)不同的組分：轉(zhuǎn)錄因子Ikaros（DNA結(jié)合亞單位）、SWI／SNF（染色質(zhì)重塑組分）和NURD（核小體重塑和組蛋白脫乙酰轉(zhuǎn)移酶亞單位）。Chakalova等［2］發(fā)現(xiàn)PYR復(fù)合物可以介導(dǎo)γ→β珠蛋白的開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)換，缺失該復(fù)合物的病人，其血液中 HbF明顯升高；O’Neill等［5］發(fā)現(xiàn)Ikaros在成人紅系造血細(xì)胞中高度表達(dá)，對(duì)造血細(xì)胞的分化有重要調(diào)控作用；Ferrante等［6］發(fā)現(xiàn)丁酸鹽等短鏈脂肪酸具有組蛋白脫乙?；敢种莆锘钚裕赏ㄟ^(guò)作用于NURD，增強(qiáng)γ珠蛋白基因的表達(dá)。因此，通過(guò)siRNA沉默Ikaros基因，逆轉(zhuǎn)或延遲γ→β珠蛋白的開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)換，或能增強(qiáng)γ珠蛋白的表達(dá)。

本文結(jié)果顯示，通過(guò)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染針對(duì)Ikaros的3種siRNA至K562細(xì)胞，均能有效沉默Ikaros基因，以siRNA3的抑制率最高。在mRNA水平上，siRNA3干擾Ikaros的效率在轉(zhuǎn)染72h后達(dá)高峰，隨后逐漸下降；γ珠蛋白mRNA和蛋白表達(dá)在Ikaros被沉默后72h有明顯增加；隨后通過(guò)聯(lián)苯胺染色法，從細(xì)胞水平上也證實(shí)在72～96hK562細(xì)胞內(nèi)γ珠蛋白的表達(dá)量明顯增加。表明siRNA3可有效抑制轉(zhuǎn)錄因子Ikaros活性，從而上調(diào)γ珠蛋白的表達(dá)，但隨著siRNA在干擾作用中的消耗和降解，其作用會(huì)逐漸減弱。

運(yùn)用siRNA3干擾Ikaros或者0.5mmol／L的丁酸鈉作用于K562細(xì)胞均可增加γ珠蛋白的表達(dá)量，說(shuō)明Ikaros和NURD在γ珠蛋白的表達(dá)過(guò)程中均起到負(fù)調(diào)控作用，它們?cè)讦谩麻_(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)換中的作用機(jī)制可能同屬于PYR復(fù)合物這一通路。然而siRNA3＋丁酸鈉聯(lián)合干擾與單獨(dú)siRNA3或丁酸鈉組相比，γ珠蛋白表達(dá)量并沒(méi)有明顯增加，二者之間沒(méi)有協(xié)同作用，其原因有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和探討。

針對(duì)γ→β珠蛋白開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)換研究已有三十余年，雖然對(duì)其認(rèn)識(shí)不斷深入，但具體機(jī)制仍不清楚。近年來(lái)對(duì)γ珠蛋白基因的一些順式或反式調(diào)控因子進(jìn)行干預(yù)，上調(diào)γ珠蛋白表達(dá)的研究報(bào)道越來(lái)越多［7，8］，體 外 研 究 結(jié) 論 也 提 示 通 過(guò) siRNA 沉 默Ikaros基因可以增加γ珠蛋白的表達(dá)，這可能為重型地中海貧血等血紅蛋白病患者提供新的治療策略。但I(xiàn)karos是正常淋巴細(xì)胞發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，在其分化和發(fā)育過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用［9］，干擾Ikaros基因是否對(duì)淋巴細(xì)胞增殖和發(fā)育造成影響及其影響程度尚需進(jìn)一步研究。

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