人工老化誘導(dǎo)的油菜種子活力和抗氧化酶活性變化的研究

曾欽薇，謝永俊

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南昆明650205）

植物種子長期貯存期間活力將逐漸喪失，但老化的速率因植物種類而異[1]。老化原因及其抗衰老機(jī)制國內(nèi)外已作了一些研究。老化期間，種子產(chǎn)生大量活性氧中間體（reactive oxygen species，ROS），ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化[2]，丙二醛（MDA）則是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低在一定程度上反映了膜脂過氧化的水平[3]。大量研究表明，自由基是種子老化的主要原因，它導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能造成巨大傷害，使種子活力衰退。種子擁有包括自由基和過氧化物清除酶在內(nèi)的一些保護(hù)機(jī)制，這些酶如過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）和超氧化物歧化酶（SOD）[2，4]。以向日葵為例，種子的老化與去氧化酶活性的降低和脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)[5]。研究還表明，種子高含水量和高溫將進(jìn)一步加速種子衰老[6]。

甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）是中國重要的油料作物，在開花前期和成熟期遭受高溫脅迫將影響種子產(chǎn)量和質(zhì)量[7]。鑒于油菜種子含有較多的脂肪，貯存期間脂質(zhì)可能更易被過氧化，進(jìn)而加速種子活力衰退，本研究通過高溫高濕處理加速新鮮油菜種子老化，測定其活力、抗氧化酶活性和MDA含量等的變化，進(jìn)一步探討種子活力衰退的生理生化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（HHS型，上海博訊），電導(dǎo)儀（JEY-45001，Jenway，UK），梅特勒XS105DU電子天平（瑞士），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf centrifuge 5810R，Germany），雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU-1901，北京普析）。

1.2 油菜種子

產(chǎn)自云南省彌勒縣的甘藍(lán)型油菜新鮮種子，品種為花油7號。

1.3 種子老化處理

參考Parrish and Leopid方法[8]，稍作改進(jìn)。每個(gè)處理選取100粒飽滿的種子，加5%次氯酸鈉溶液渦旋消毒3 min，去離子水漂洗3次，用濾紙吸干；轉(zhuǎn)入平皿，攤平，置45℃水浴，水浴鍋加蓋密封（使相對濕度保持100%）。老化處理1 d、2 d、3 d，測定各生理指標(biāo)。

1.4 測定方法

1.4.1 種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率和發(fā)芽速率測定

采用GB/T3543.4-1995技術(shù)規(guī)范測定種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和發(fā)芽速率[9]。老化時(shí)間分別為0 d（CK）、2 d、4 d、6 d，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理50粒種子。發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt），活力指數(shù)（VI）=GI×S，發(fā)芽率（%）=發(fā)芽終期全部正常種苗數(shù)/供試種子數(shù)×100，發(fā)芽速率（日）=∑（Gt×Dt）/發(fā)芽率。式中，Gt為每天的發(fā)芽粒數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽日數(shù)，S為觀察結(jié)束時(shí)幼苗長度（根長+莖長，cm）。

1.4.2 種子相對電導(dǎo)率的測定

種子發(fā)生劣變時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性受到傷害，質(zhì)膜透性增加。透性增加將使種子向周圍介質(zhì)溶液滲漏出較多的電解質(zhì)，使溶液電導(dǎo)率增加，電導(dǎo)率的高低則反映出種子質(zhì)膜的受損程度，受損越嚴(yán)重，種子活力越低。仿Zhang等方法[10]，并適當(dāng)改進(jìn)。取經(jīng)不同時(shí)間[0 d（CK）、1 d、2 d、3 d]加速老化處理的5粒種子放入盛有5 ml去離子水的具塞試管內(nèi)，置于25℃/120 rpm搖床振蕩1 h，測定初電導(dǎo)率（ECi）；試管轉(zhuǎn)入100℃沸水浴中加熱10 min，流水冷卻到室溫，測定終電導(dǎo)率（ECt）。以ECi/ECt表示相對電導(dǎo)率。3個(gè)重復(fù)。

1.4.3 MDA測定

參照Dhindsa等硫代巴比妥酸法[11]。3個(gè)重復(fù)。

1.4.4 POD、SOD和CAT活性測定

采用陳建勛等方法[12]測定CAT、POD和SOD活性。3個(gè)重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 老化處理對油菜種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率和發(fā)芽速率的影響

從表1可見，油菜種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率和發(fā)芽速率隨著老化時(shí)間的延長而降低，前3個(gè)指數(shù)各老化時(shí)間之間及其與對照組之間差異極顯著（p＜0.01）。發(fā)芽速率與對照組差異也極顯著（p＜0.01）。顯然，加速老化使油菜種子的活力大大降低。

表1 老化處理油菜種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率和發(fā)芽速率（n=3）

表1 老化處理油菜種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率和發(fā)芽速率（n=3）

項(xiàng)目 老化時(shí)間(d)0（CK）1 2 3發(fā)芽指數(shù) 41.5±8.6A 20.4±5.7B 13.2±3.4C 1.1±0.3D活力指數(shù) 256.9±33.4A 67.7±13.6B 28.8±9.3C 2.8±1.1D發(fā)芽率（%）99.7±0.1A 88.1±3.3B 64.8±5.3C 8.2±2.2D發(fā)芽速率（日）0.7±0.1A 1.3±0.1B 1.5±0.2C 2.1±0.2D

表2 老化處理對油菜種子的相對電導(dǎo)率和生化指標(biāo)的影響（，n=3）

表2 老化處理對油菜種子的相對電導(dǎo)率和生化指標(biāo)的影響（，n=3）

老化時(shí)間（d）0（CK）1 2 3相對電導(dǎo)率 0.10±0.03 a 0.12±0.02 ab 0.17±0.05 bc 0.19±0.03 c項(xiàng)目MDA 含量（μmol·g-1）2.32±0.61 a 3.49±1.12 ab 3.68±0.83 ab 5.14±1.90 b POD 活性（U·min-1·g-1FW）186.54±33.43 161.72±21.56 118.85±13.32 67.81±12.11 SOD 活性（U·min-1·g-1FW）135.23±13.19 123.15±11.37 78.78±5.34 53.28±4.92 CAT 活性（U·min-1·g-1FW）151.67±8.13 129.36±15.18 67.52±7.21 42.14±5.62

2.2 老化處理對油菜種子細(xì)胞膜完整性的影響

從表2可見，種子滲出液的相對電導(dǎo)率隨著老化時(shí)間的延長而增加。方差分析表明，老化2 d、3 d與對照、老化1 d與3 d差異顯著（p＜0.05），但老化1 d與對照、老化2 d與老化3 d差異不顯著（p＞0.05）。顯然，老化時(shí)間越長，油菜種子細(xì)胞膜的完整性被破壞越大，將降低種子的活力。

表3 老化處理油菜種子活力與各生理指標(biāo)之間的相關(guān)性

2.3 老化處理對油菜種子MDA含量的影響

隨著老化時(shí)間的延長，MDA含量呈逐漸上升趨勢（表2）。方差分析表明，老化3 d與對照組差異顯著（p＜0.05），其余各組之間差異不顯著（p＞0.05）。顯然，老化時(shí)間越長，油菜種子中的脂質(zhì)更多地被過氧化，進(jìn)而加速種子活力衰退。

2.4 老化處理對油菜種子POD、SOD和CAT活性的影響

隨著老化時(shí)間的延長，油菜種子中POD、SOD和CAT的活性呈下降趨勢（表2），老化時(shí)間越長，與對照的差異越大。顯然，隨著老化時(shí)間的延長，種子內(nèi)上述過氧化物清除酶的活性降低，脂質(zhì)將更多地被過氧化，使種子活力下降。

2.5 種子活力與上述各生理指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析表明，油菜種子活力與相對電導(dǎo)率和MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而與POD、SOD和CAT活性（表3）呈顯著正相關(guān)（p＜0.05）。

3 討論

種子中自由基的產(chǎn)生將加速脂質(zhì)過氧化，并破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。所產(chǎn)生的自由基如果不能被清除，必將因脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞，使種子老化，活力降低。細(xì)胞中產(chǎn)生的超氧化物自由基和膜脂中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化是膜被破壞的原因[3]。因此，種子中的自由基和過氧化物清除酶—SOD、POD、CAT、APX、GR在種子抗衰老中的作用十分重要。SOD催化2分子過氧化物為分子氧和H2O2[13]。CAT、POD、APX與 H2O2清除有關(guān)，APX用抗壞血酸作為電子供體將H2O2還原為水[14]，GR通過谷胱甘肽—抗壞血酸氧化還原循環(huán)在內(nèi)生H2O2控制中起作用[15]，而且，抗壞血酸和谷胱甘肽在植物中是重要的抗氧化劑[16]。

在本研究中，加速老化使油菜種子中POD、SOD和CAT活性及質(zhì)膜的完整性降低，過氧化產(chǎn)物MDA含量增加，外在表現(xiàn)為種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率和發(fā)芽速率下降。本研究與Afshari等[17]測定的人工老化油菜種子結(jié)果相似。POD活性的變化與王煜等[18]測定的自然老化19年的油菜種子的結(jié)果相一致。

綜上所述，油菜種子老化期間各種抗氧化酶活性的下降、脂質(zhì)的過氧化、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞，是其老化和活力衰退的原因。鑒于高溫高濕是誘導(dǎo)種子老化的重要外因，在貯存油菜種子時(shí)應(yīng)將其含水量降至安全范圍，同時(shí)要降低貯存溫度，以延長種子壽命。

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