跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)比目魚(yú)肌和腓腸肌肌肉生長(zhǎng)抑制素表達(dá)的影響

張 靚，劉小園，楊洪濤

（北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京 100875）

?運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)

跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)比目魚(yú)肌和腓腸肌肌肉生長(zhǎng)抑制素表達(dá)的影響

張 靚，劉小園，楊洪濤

（北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京 100875）

目的:分別觀(guān)察運(yùn)動(dòng)促進(jìn)的骨骼肌肥大時(shí)，比目魚(yú)肌和腓腸肌肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin，MSTN）表達(dá)的變化。方法:16周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組，每組10只。跑臺(tái)訓(xùn)練持續(xù)8周，每周5次，每次60min，跑速26m/min。測(cè)定兩組大鼠肌重脛骨長(zhǎng)的比值，HE染色觀(guān)察骨骼肌纖維橫截面積，分別采用real－time PCR技術(shù)和western blot方法測(cè)定比目魚(yú)肌和腓腸肌MSTN mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果:運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌重量/脛骨長(zhǎng)顯著升高（P＜0.05），兩種肌纖維橫截面積均增大。與對(duì)照組相比，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著抑制了大鼠腓腸肌MSTN的mRNA和蛋白表達(dá)（P＜0.05），但對(duì)比目魚(yú)肌MSTN表達(dá)的影響無(wú)顯著性。結(jié)論:運(yùn)動(dòng)對(duì)MSTN的作用可能存在肌纖維特異性。

肌肉生長(zhǎng)抑制素;肌肉肥大;比目魚(yú)肌;腓腸肌

肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin，MSTN），即生長(zhǎng)分化因子8（growth differentiation factor 8，GDF－8），為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（transforming growth factor beta，TGFβ）超家族成員之一，具有與TGFβ超家族的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。MSTN基因先合成含375個(gè)氨基酸的前體蛋白，經(jīng)二次蛋白酶酶解活化，首先切除23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽形成前肽，之后在第263－266位被裂解，形成N端約243個(gè)氨基酸和C端109個(gè)氨基酸的多肽，后者以二硫鍵的方式結(jié)合成二聚體，與膜上的特異性受體結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)作用［1］。MSTN在骨骼肌大量表達(dá)，并因其對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)具有強(qiáng)大的負(fù)調(diào)控能力而備受關(guān)注［2］。大量研究證實(shí)，不管是在 MSTN表達(dá)缺失的動(dòng)物［3－4］，還是在 MSTN突變的人群［5］，均出現(xiàn)了異常的肌肉肥大。此外，后天使用MSTN抑制劑［6］、MSTN抗體或使用短發(fā)卡RNA干擾MSTN的表達(dá)后［7］，也同樣誘導(dǎo)了肌肉質(zhì)量的增加。與此相反，當(dāng)過(guò)表達(dá)MSTN時(shí)則誘導(dǎo)小鼠骨骼肌萎縮［8－9］，并且在肌肉萎縮的動(dòng)物模型［10］和臨床肌肉萎縮的患者［11－12］均出現(xiàn)骨骼肌中MSTN表達(dá)的顯著增強(qiáng)，提示MSTN參與了骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能的生理和病理生理調(diào)節(jié)。

但目前，越來(lái)越多的研究提示，MSTN對(duì)骨骼肌的作用存在肌纖維特異性。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在多種以II型肌纖維萎縮為主的肌肉萎縮性疾病，如惡變質(zhì)時(shí)的肌肉萎縮、長(zhǎng)期糖皮質(zhì)激素治療引起的肌肉萎縮等，均發(fā)現(xiàn)骨骼肌MSTN表達(dá)顯著升高［13］。在食物剝奪誘導(dǎo)的小鼠II型纖維肌肉萎縮模型上［14］，發(fā)現(xiàn)脛骨前肌出現(xiàn)了MSTN mRNA表達(dá)的顯著上調(diào);在去神經(jīng)誘導(dǎo)的肌萎縮大鼠模型［15］，同樣是在腓腸肌中MSTN表達(dá)上調(diào)，并且與腓腸肌的萎縮程度呈顯著相關(guān)。而在大鼠懸掛模型中，比目魚(yú)肌濕重減輕42%，腓腸肌濕重減輕17%，但只有在腓腸肌中MSTN mRNA水平升高67%，提示MSTN的表達(dá)不與骨骼肌的萎縮程度相關(guān)，而是與萎縮的IIb型肌球蛋白重鏈顯著相關(guān)［16］。此外，在MSTN基因敲除的小鼠，骨骼肌肌纖維類(lèi)型也向糖酵解型肌纖維方向轉(zhuǎn)變［17－19］。上述研究提示，MSTN的表達(dá)變化對(duì) II型肌纖維有著特異性的調(diào)節(jié)作用。

大量文獻(xiàn)報(bào)道了運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌MSTN表達(dá)的影響，但長(zhǎng)期的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)不同肌纖維中MSTN的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響尚不明確。本研究觀(guān)察長(zhǎng)期的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠比目魚(yú)肌（I型肌纖維為主）和腓腸?。↖I型肌纖維為主）中MSTN的mRNA和蛋白表達(dá)的變化，探究運(yùn)動(dòng)對(duì)MSTN的作用是否也存在肌纖維特異性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

實(shí)驗(yàn)所有動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)程序按中國(guó)動(dòng)物管理?xiàng)l例（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2001年第55號(hào)文件）批準(zhǔn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。16周齡雄性SD大鼠由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXY（京）2002－000。常規(guī)條件下飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為（22±2）℃，濕度為40% ～60%，自由進(jìn)食和飲水。MSTN抗體及β－actin抗體均自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑系市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)模型建立

大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組，每組10只。運(yùn)動(dòng)組采用跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，在第1周內(nèi)，跑臺(tái)速度逐漸加快至26m/min［20］，跑臺(tái)時(shí)間逐漸延長(zhǎng)至60min。正式跑臺(tái)訓(xùn)練持續(xù)8周，每周5次，每次60min。每次訓(xùn)練在下午3點(diǎn)至6點(diǎn)間進(jìn)行，不使用光、電等刺激手段。兩組動(dòng)物均常規(guī)飼養(yǎng)8周后進(jìn)行下述檢測(cè)。

1.3 取材及組織準(zhǔn)備

大鼠末次運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，禁食過(guò)夜，自由飲水，腹腔注射烏拉坦（1g/kg）。放血處死動(dòng)物后，分離比目魚(yú)肌和腓腸肌，濾紙吸干稱(chēng)重，測(cè)量脛骨長(zhǎng)度，用于計(jì)算肌肉重量與脛骨長(zhǎng)度比。取少許比目魚(yú)肌和腓腸?。ò准〔糠郑┙M織10%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。其余骨骼肌組織用錫箔紙包裹、標(biāo)記后先于液氮中暫存，后轉(zhuǎn)于－80℃保存，分別進(jìn)行下述測(cè)定。

1.4 Real－time PCR測(cè)定骨骼肌MSTN mRNA水平

骨骼肌總RNA的提取采用Trizol一步法進(jìn)行，采用Promega逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Promega，Madison，WI，USA）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。real－time PCR反應(yīng)體積10μL:10×緩沖液1mL，10mmol/L dNTP混合物0.5mL，10mmol/L的上下游引物各0.25ml，cDNA 模板 2.5ml，Taq DNA 多聚酶 0.2ml，SYBR green I 0.4ml。MSTN的上游引物:AGC CTG AAT CCA ACT TAG;下游引物為:GTT CAT CAC AGT CAA GCC;β－actin的上游引物:5’－GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC －3’;下游引物為:5’－TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA－3’。經(jīng)95℃ 7min變性后，MSTN 和 β－actin分別進(jìn)行:95℃30 s，54.2℃ 30 s，72℃40 s，熱循環(huán) 42 次和 95℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 40s，熱循環(huán)45次。Real－time PCR于Mx3000P多通道實(shí)時(shí)定量PCR儀（Stratagene，La Jolla，CA，USA）上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用 β －actin作為內(nèi)參。

1.5 Western－blot測(cè)定骨骼肌MSTN的蛋白表達(dá)

分別取比目魚(yú)肌和腓腸?。ò准〔糠郑┙M織50mg，蛋白裂解液勻漿，離心后取上清，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。同等蛋白量的樣品經(jīng)十二烷基磺酸鈉－2－聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳后，轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉1h，MSTN（1:1000）、β －actin（1∶2000）一抗孵育，4℃過(guò)夜，二抗孵育1h，經(jīng)顯色后曝光。蛋白表達(dá)水平用NIH圖像分析軟件（Bethesda，Maryland，USA）進(jìn)行分析，β－actin作為內(nèi)參。

1.6 數(shù)理統(tǒng)計(jì)法

2 結(jié)果

2.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)大鼠比目魚(yú)肌和腓腸肌肥大的發(fā)生

與對(duì)照組相比，8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，大鼠的比目魚(yú)肌重/脛骨長(zhǎng)和腓腸肌重/脛骨長(zhǎng)均顯著升高（P＜0.05）（圖1A，1B）。HE染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組大鼠比目魚(yú)肌和腓腸肌纖維橫截面積顯著增大（圖1C，1D），提示骨骼肌肥大的發(fā)生。

圖1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腓腸肌/脛骨長(zhǎng)（A），比目魚(yú)肌/脛骨長(zhǎng)（B），腓腸肌纖維橫截面積（C）及比目魚(yú)肌橫截面積（D）的影響

2.2 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)抑制大鼠腓腸肌MSTN的mRNA和蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組大鼠腓腸肌MSTN的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）（圖2A，2B）。

2.3 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)不影響大鼠比目魚(yú)肌MSTN的mRNA和蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)不影響大鼠比目魚(yú)肌MSTN的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平（P＞0.05）（圖3A，3B）。

圖2 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腓腸肌和比目魚(yú)肌MSTN mRNA表達(dá)的影響

圖3 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腓腸肌和比目魚(yú)肌MSTN蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肌球蛋白是構(gòu)成骨骼肌纖維粗肌絲的主要成分，是骨骼肌纖維中表達(dá)最多的蛋白。天然的肌球蛋白由6條多肽鏈組成，包括兩條重鏈和兩對(duì)不同的輕鏈。肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）在成年骨骼肌有 I－MHC、Ⅱa－MHC、Ⅱx－MHC和Ⅱb－MHC 4種類(lèi)型，在不同肌肉、肌肉不同區(qū)域及不同動(dòng)物，MHC表達(dá)的類(lèi)型和數(shù)量會(huì)有所差異，慢肌主要表達(dá)I型及部分Ⅱa型MHC，如比目魚(yú)肌和股中間肌;快肌如腓腸肌、足底肌、股四頭肌、趾長(zhǎng)伸肌、脛骨前肌等主要以Ⅱx、Ⅱb MHC組成。在本實(shí)驗(yàn)中，選取I型MHC為主的比目魚(yú)肌和IIb型MHC為主的腓腸肌，發(fā)現(xiàn)8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了比目魚(yú)肌和腓腸肌肥大的發(fā)生，該結(jié)果與以往的文獻(xiàn)報(bào)道相一致［21］。

運(yùn)動(dòng)可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)骨骼肌肥大，近來(lái)骨骼肌內(nèi)分泌功能的發(fā)現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼肌肥大機(jī)制研究提供了新的方向。運(yùn)動(dòng)可通過(guò)肌肉收縮活動(dòng)，調(diào)節(jié)骨骼肌旁/自分泌及內(nèi)分泌功能穩(wěn)態(tài)，參與骨骼肌的生長(zhǎng)、代謝和運(yùn)動(dòng)功能［22］。MSTN是骨骼肌表達(dá)、合成和分泌的肌肉因子，具有強(qiáng)大抑制肌肉生長(zhǎng)的作用。MSTN對(duì)骨骼肌的作用有明顯的肌纖維特異性。Carlson CJ等［16］研究發(fā)現(xiàn)，MSTN的mRNA表達(dá)與骨骼肌中IIb MHC的含量呈線(xiàn)性正相關(guān)。在MSTN基因敲除的小鼠，骨骼肌中IIb MHC含量顯著升高，IIa MHC的含量顯著降低，與此結(jié)構(gòu)變化相對(duì)應(yīng)，骨骼肌中線(xiàn)粒體的數(shù)目、琥珀酸脫氫酶的活性均降低，疲勞易感度增加，骨骼肌的代謝向糖酵解方向轉(zhuǎn)化［17－19］，可見(jiàn)，MSTN的表達(dá)變化主要參與了IIb MHC結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)。在實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)顯著抑制了腓腸肌中MSTN mRNA和蛋白表達(dá)，但并不影響比目魚(yú)肌中MSTN mRNA和蛋白表達(dá)，提示在運(yùn)動(dòng)促進(jìn)的肌肉肥大中，MSTN的作用同樣也具有肌纖維類(lèi)型的特異性，只參與了運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的IIb型MHC肥大。

運(yùn)動(dòng)通過(guò)何種機(jī)制調(diào)節(jié)MSTN的表達(dá)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。Spiller MP等［23］報(bào)道，骨骼肌成肌調(diào)節(jié)因子Myo D可促進(jìn)MSTN的啟動(dòng)子激活，上調(diào)MSTN的表達(dá)，抑制肌肉肥大。運(yùn)動(dòng)是否通過(guò)Myo D－MSTN途徑對(duì)MSTN的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)還需更多的研究來(lái)證實(shí)。

綜上所述，運(yùn)動(dòng)通過(guò)抑制腓腸肌MSTN的mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)腓腸肌肥大的形成;運(yùn)動(dòng)不影響比目魚(yú)肌MSTN的表達(dá)，運(yùn)動(dòng)促進(jìn)的比目魚(yú)肌肥大可能存在其他的調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果提示，在運(yùn)動(dòng)促進(jìn)的肌肉肥大中，MSTN的作用具有肌纖維特異性。

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Effects of Treadmill Running on Myostatin Expression in Soleus and Gastrocnemius Muscle of Rats

ZHANG Jing，LIU Xiaoyuan，YANG Hongtao
（School of P.E.and Sports，Beijing Normal University，Beijing 100875，China）

Objective:To observe the effects of treadmill running on the myostatin（MSTN）expression in soleus and gastrocnemius muscle of rats.Methods:Male 16-week-old SD rats were randomly divided into control group（n=10）and treadmill running group（n=10）.The exercise rats underwent treadmill running at 26 m/min（60 min each，5 days/week for 8 weeks）.The ratio of muscle weight/tibia length was measured，the cross section area of muscle was observed using the HE stain，and the mRNA and protein expression of MSTN were detected by real-time PCR and western bolt，respectively.Results:The soleus weight/tibia length and gastrocnemius weight/tibia length increased significantly in exercise group（both P＜0.05）and the muscle cell cross section area enlarged markedly.Compared with the control group，treadmill training rats showed decreased MSTN mRNA and protein level in gastrocnemius muscle significantly（both P ＜ 0.05），however，no difference were detected in soleus muscle.Conclusion:These results showed that the effects of treadmill running on MSTN expression were muscle fiber specific.

myostatin;muscle hypertrophy;soleus muscle;gastrocnemius muscle

G804.23

A

1004－0560（2012）05－0073－03

2012-04-12;

2012-05-19

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助。

張 靚（1976－），女，副教授，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心血管活性物質(zhì)研究;運(yùn)動(dòng)與骨骼肌活性物質(zhì)研究。

責(zé)任編輯:喬艷春