核磷蛋白小分子抑制劑NSC348884對肝癌細胞HepG2的體外抑制作用

張 潔，趙浩亮，賀杰峰，李輝宇

山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院普通外科，太原030001

原發(fā)性肝癌是世界上最高發(fā)的癌癥之一，早期診斷率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多為晚期［1-2］，因此尋求新型有效的抗肝癌藥物具有重要意義。NSC348884是Qi等［3］于2008年首次報道的一種核磷蛋白 (nucleophosmin，NPM)小分子抑制劑。它能特異性破壞NPM氨基末端的疏水口袋結(jié)構(gòu)，從而抑制NPM寡聚物的形成，破壞其在癌細胞中的異常功能。該研究表明NSC348884可在多種癌細胞系中抑制細胞的增殖，包括前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、淋巴癌。因此，NSC348884將可能成為抗癌治療的新型藥物。最新研究表明，NPM在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中呈高表達，可能是潛在的HCC標志物［4］。NPM將可能成為肝癌治療的新靶點，而關(guān)于NSC348884對肝癌細胞的作用尚少有報道。本研究旨在觀察NSC348884對肝癌細胞HepG2體外生長的抑制效應(yīng)，并探討其作用機制。

材料和方法

細胞培養(yǎng)HepG2肝癌細胞株 (購自中國科學院)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(另加入青霉素50 U/ml和鏈霉素60 μg/ml)中，溫度37℃，含5%的CO2，選用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

噻唑藍檢測細胞增殖HepG2細胞以5×104/ml的濃度接種于96孔板中，每孔200 μl，設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后更換NSC348884(美國Sigma公司)終濃度為0、0.01、0.1、1、2、5、10、40、50 μmol/L 的10%胎牛血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)4 d后，加入噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，4 h后，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜100 μl，培育5 min，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度。實驗組按下列公式計算細胞存活率:存活率 (%)=加藥細胞平均吸光度值/對照細胞平均吸光度值×100%，繪制細胞增殖曲線圖。

免疫印跡法檢測寡聚物及單體的表達變化0 μmol/L(空白對照)、2 μmol/L NSC348884 分別處理肝癌細胞HepG2，24 h后胰酶消化，收集細胞。按核蛋白提取試劑盒方法提取核蛋白。Bradford法進行蛋白質(zhì)定量。取50 μg蛋白質(zhì)分別做濃度為15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (native polyacrylamide gel electrophoresis，native PAGE)，電泳完畢將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，小牛血清封閉2 h，兔抗人NPM一抗 (CST公司)1∶1000室溫孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗 (美國Santa Cruz Biotechnology公司)室溫孵育1 h，最后使用二氨基聯(lián)苯胺試劑顯色 (美國DAKO公司)。

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率0、1、2 μmol/L的NSC348884處理細胞，培養(yǎng)24 h后收集細胞，冷磷酸鹽緩沖液洗滌，重懸于4℃、70%酒精中固定過夜，離心后加入200 μg/ml RNA酶400 μl 37℃處理30 min，再加入 15 μg/ml碘化丙啶 100 μl 4℃避光處理30 min，流式細胞儀 (美國Beckman公司)檢測細胞凋亡率。

統(tǒng)計學處理所有實驗均重復(fù)3次，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，采用兩獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

NSC348884抑制HepG2細胞增殖活性MTT結(jié)果顯示，NSC348884在0.01 μmol/L低濃度時吸光度與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05);濃度為0.1 μmol/L 和 1 μmol/L 時，細胞存活率分別為(72.333±5.774)%和 (74.667±4.163)%、二者比較差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05);當濃度在1～10 μmol/L之間時，明顯抑制了細胞的生長，濃度為2、5、10 μmol/L時存活率分別為(35.333±4.041)%、(17.667±2.082)%、(22.333±2.887)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);NSC348884濃度為 40、50 μmol/L時，存活率分別為 (26.333±1.528)%、(28.000±1.732)%、二者比較差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。NSC348884對肝癌細胞HepG2的半數(shù)抑制濃度 (50%inhibiting concentration，IC50)為 1.4 μmol/L。

NSC348884破壞HepG2細胞NPM寡聚物結(jié)構(gòu)0 μmol/L 及2 μmol/L NSC348884 處理 HepG2 細胞24 h后，與0 μmol/L組相比，2 μmol/L組的NPM寡聚物表達量明顯降低，而單體的表達量增高 (圖1)。圖像分析結(jié)果顯示，2 μmol/L組寡聚物蛋白條帶灰度比值 (0.289±0.035)明顯低于0 μmol/L組寡聚物蛋白條帶灰度比值 (1.443±0.041)(P＜0.05);而2 μmol/L組單體蛋白條帶灰度比值(1.781±0.101)明顯高于0 μmol/L組單體蛋白條帶灰度比值 (1.122±0.007)(P＜0.05)。

圖1 NSC348884特異性破壞NPM寡聚物結(jié)構(gòu)Fig 1 NSC348884 specifically disrupts NPM oligomer

NSC348884誘導HepG2細胞的凋亡0、1、2 μmol/L NSC348884處理HepG2細胞24 h后，凋亡率分別為 (6.950±0.207)%、(13.770±0.335)%、(19.021±0.237)%。處理組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P ＜0.05);2 μmol/L與1 μmol/L處理組比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)(圖2)。

討 論

HCC一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多為晚期，對不宜手術(shù)者，化療是主要的治療方法?；熕幬锏淖饔脵C制很多，而蛋白-蛋白相互作用位點是強有力的干預(yù)靶點，是發(fā)展抗癌藥物的熱點，目前以蛋白-蛋白相互作用位點為靶點的化療藥物的應(yīng)用已經(jīng)成為現(xiàn)實［5］。

NPM是主要的核仁磷酸化蛋白，其結(jié)構(gòu)特征包括一個氨基末端保守的寡聚化區(qū)［6-7］，NPM的寡聚化可能是調(diào)節(jié)NPM多種功能的必要步驟［8］。研究表明，NPM在多種實體腫瘤中存在高表達，被認為是結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌的腫瘤標志物之一［9］。此外，有研究表明Rev蛋白的一個肽與NPM結(jié)合使Ras轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細胞產(chǎn)生細胞毒性，從而抑制裸鼠模型中腫瘤的生長［10］。這是關(guān)于抑制NPM后產(chǎn)生抗腫瘤作用的首次報道。

圖2 NSC348884誘導肝癌細胞HepG2凋亡Fig 2 NSC348884 induces the apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line HepG2

基于上述研究，Qi等［3］通過對NPM分子模型三維結(jié)構(gòu)的研究，確定影響其寡聚物形成的藥效基團，然后經(jīng)計算機篩選以及相互作用而確定了一種NPM的小分子抑制劑——NSC348884。他們的研究表明NSC348884以1.7～4.0 μmol/L的IC50在多種癌細胞系中抑制了細胞的增殖。Yun等［4］的最新研究證實，NPM在HCC中呈高表達，且顯著高于非癌肝組織;NPM在HCC中的高表達與增殖細胞核抗原水平以及血清甲胎蛋白、肝硬化等臨床預(yù)后參數(shù)相關(guān);NPM可能是潛在的HCC標志物。因此，NPM可能是一個潛在的原癌基因，將可能成為肝癌治療的新靶點。

本研究應(yīng)用MTT比色法測定NSC348884對HepG2細胞存活率的影響，結(jié)果顯示NSC348884對肝癌細胞HepG2生長有抑制作用，藥物濃度在1～10 μmol/L之間時，對細胞的抑制作用最明顯，隨藥物濃度增加，細胞的存活率降低，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。NSC348884的IC50為1.4 μmol/L。隨后通過對不同濃度NSC348884處理組進行Native PAGE、SDSPAGE免疫印跡檢測，結(jié)果表明NSC348884能特異性破壞肝癌細胞HepG2中NPM寡聚物結(jié)構(gòu)，促使其寡聚物轉(zhuǎn)化為單體，這是NSC348884發(fā)揮抗腫瘤作用的分子基礎(chǔ)。

研究表明，NSC348884通過上調(diào)p53(增加15位絲氨酸的磷酸化)，以劑量依賴方式誘導多種腫瘤細胞的凋亡［3］。本研究用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，結(jié)果顯示NSC348884以劑量依賴方式誘導了肝癌細胞HepG2凋亡的發(fā)生，而有關(guān)誘導肝癌細胞凋亡的具體機制尚需進一步研究。

綜上所述，本研究顯示NSC348884通過促使肝癌細胞HepG2中NPM寡聚物轉(zhuǎn)化為單體，從而抑制HepG2細胞的體外增殖，并且可以誘導肝癌細胞凋亡，而其誘導肝癌細胞凋亡的機制尚需進一步研究。

［1］Takigawa Y，Brown AM.Wnt signaling in liver cancer［J］.Curr Drug Targets，2008，9(11):1013-1024.

［2］Lewis RR，Gregory JG.Emerging drugs for hepatocellular carcinoma ［J］.Expert Opin Emerg Drugs，2006，11(3):469-487.

［3］Qi W，Shakalya K，Stejskal A，et al.NSC348884，a nucleophosmin inhibitor disrupts oligomer formation and induces apoptosis in human cancer cells ［J］.Oncogene，2008，27(30):4210-4220.

［4］Yun JP，Miao J，Chen GG，et al.Increased expression of nucleophosmin/B23 in hepatocellular carcinoma and correlation with clinicopathological parameters ［J］.Br J Cancer，2007，96(3):477-484.

［5］Arkin MR，Wells JA.Small-molecule inhibitors of proteinprotein interactions:progressing towards the dream ［J］.Nat Rev Drug Discov，2004，3(4):301-317.

［6］Wang D，Umekawa H，Olson MO.Expression and subcellular locations of two forms of nucleolar protein B23 in rat tissues and cells［J］.Cell Mol Biol Res，1993，39(1):33-42.

［7］Wang W，Budhu A，F(xiàn)orgues M，et al.Temporal and spatial control of nucleophosmin by the Ran-Crm1 complex in centrosome duplication ［J］.Nat Cell Biol，2005，7(8):823-830.

［8］Lim MJ，Wang XW.Nucleophosmin and human cancer［J］.Cancer Detect Prev，2006，30(6):481-490.

［9］Grisendi S，Mecucci C，F(xiàn)alini B，et al.Nucleophosmin and cancer ［J］.Nat Rev Cancer，2006，6(7):493-505.

［10］Chan HJ，Weng JJ，Yung BY.Nucleophosmin/B23-binding peptide inhibits tumor growth and up-regulates transcriptional activity of p53 ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，333(2):396-403.