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    肺金生方對(duì)Lewis肺癌小鼠VEGF-C、nm23表達(dá)的影響

    2012-11-08 03:43:34龐德湘邊至慰浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科杭州310053
    關(guān)鍵詞:肺金生理鹽水低劑量

    龐德湘 周 楠 邊至慰 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科 杭州310053

    原發(fā)性支氣管肺癌(簡(jiǎn)稱(chēng)肺癌)是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤,第三次全國(guó)居民死因調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)肺癌的病死率與30年前相比上升了46.5%,已成為我國(guó)首位惡性腫瘤死亡原因[1]。肺金生方由《金匱要略》經(jīng)典方澤漆湯結(jié)合現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果化裁而成,臨床治療肺癌患者療效顯著[2],近年有關(guān)于其療效的臨床報(bào)道,但有關(guān)其抗腫瘤機(jī)制的研究尚為少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察肺金生方對(duì)Lewis 肺癌小鼠VEGF-C、nm23表達(dá)的影響,探討肺金生方抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制及途徑,從而為臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株 C57BL/6小鼠60只,雄性,5~6周齡,體質(zhì)量18~20g,清潔級(jí),購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。Lewis荷瘤鼠:購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

    1.2 藥 物 肺金生方,由澤漆30g,前胡10g,人參、桂枝各9g,紅豆杉枝8g,蜂房15g,石見(jiàn)穿30g 等組成,按《中藥藥理研究方法學(xué)》計(jì)算小鼠的等效劑量,肺金生方低、中、高劑量分別相當(dāng)于臨床成人用量的5、10、20 倍,常規(guī)水煎,取煎液濃縮,濃縮成0.925、1.85、3.7g/mL。滅菌后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 主要試劑及儀器 兔抗鼠VEGF-C、VEGFR-D、P53、nm23、PCNA 單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,多聚賴氨酸、SP-9001、DAB試劑盒購(gòu)于杭州達(dá)文生物有限公司。超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司),電子顯微鏡(日本,Nikon.E80i型),多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus);切片機(jī)(德國(guó)萊卡RM2015);離心機(jī)(北京離心機(jī)廠LDZ5-2 型);干燥箱(日本三洋MIR-153型);恒溫水浴箱(江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 動(dòng)物造模及分組 將Lewis 荷瘤小鼠脫頸椎處死,放入75%酒精中浸泡消毒10min,在超凈工作臺(tái)上分離瘤體。取其中生長(zhǎng)良好、無(wú)壞死的腫瘤組織,用生理鹽水沖洗后剪碎,經(jīng)0.25%胰蛋白酶室溫下消化5min,過(guò)300目尼龍網(wǎng)制成小鼠Lewis 肺癌無(wú)菌單細(xì)胞懸液,用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/mL;臺(tái)盼藍(lán)染色后示:活細(xì)胞比例>95%,取60 只C57BL/6小鼠,將配制好的細(xì)胞懸液接種至每只小鼠右腋皮下,每只接種0.2mL。隨機(jī)分生理鹽水組、CTX組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組和CTX加中藥中劑量組,每組10只。

    2.2 給藥方法 接種24h 后給藥,生理鹽水組予生理鹽水0.2mL灌胃,1天1次,共14天;中藥低、中、高劑量組予相應(yīng)濃度中藥肺金方0.2mL灌胃,1天1次,共14天;CTX 組予CTX 20mg/kg,腹腔內(nèi)注射,1天1次,第1~5天,同時(shí)予生理鹽水10mL/kg 灌胃,1天1次,共14天。CTX 加中藥組予中藥中劑量0.2mL 灌胃,1天1次,共14天,同時(shí)給予CTX 20mg/kg,腹腔內(nèi)注射,1天1次,第1~5天。

    2.3 標(biāo)本采集 灌胃14天后,動(dòng)物禁食不禁水12h,脫頸處死后,剝?nèi)×鰤K,10﹪甲醛固定。

    2.4 檢測(cè)小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù) 取肺,光鏡觀測(cè)肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。

    2.5 瘤塊及瘤周?chē)M織VEGF-C、nm23 檢測(cè) 采用免疫組化SP法,一抗為兔抗鼠單克隆抗體,1∶100 稀釋?zhuān)锼鼗篂樯窖蚩剐∈驣gG,滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素,二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化。脫水、透明、封片、鏡檢。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,VEGF-C 為腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性,nm23以細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色判為陽(yáng)性。在10×40 倍高倍鏡下,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥25%為陽(yáng)性表達(dá)。采集免疫組織化學(xué)染色圖像,用Image-Pro Plus 分析軟件進(jìn)行圖像分析,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野測(cè)定瘤組織中陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度。

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以()表示,兩組間比較用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 肺金生方對(duì)Lewis 肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響

    除中藥低劑量組外,各處理組肺轉(zhuǎn)移數(shù)與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺加中藥組與中藥各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);中藥中、高劑量組與中藥低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說(shuō)明肺金生方對(duì)Lewis肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響與其濃度有一定關(guān)系,見(jiàn)表1。

    表1 各組Lewis肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)比較()個(gè)

    表1 各組Lewis肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)比較()個(gè)

    注:與生理鹽水組比較,*P<0.01;與中藥高、中、低劑量組比較,△P<0.01;與中藥低劑量組比較,▲P<0.01

    3.2 肺金生方對(duì)Lewis 肺癌移植瘤細(xì)胞VEGF-C、nm23蛋白表達(dá)的影響 與生理鹽水組比較,中藥各劑量組及CTX、CTX 加中藥組均能降低VEGF-C 表達(dá)(P<0.05、P<0.01);中藥中、高劑量組、CTX 加中藥組均能提高nm23 表達(dá)(P<0.01),中藥中、高劑量組的nm23表達(dá)又高于CTX加中藥組(P<0.01),見(jiàn)表2。

    4 討論

    肺金生方來(lái)源于《金匱要略》經(jīng)典方澤漆湯,方中以澤漆為君,功專(zhuān)消痰行水,人參助澤漆逐水消痰,扶正固本,桂枝、前胡、生姜溫陽(yáng)化飲,降氣消痰。人參、甘草健脾以扶正氣,佐黃芩以清泄水飲久留所化之郁熱,加用蜂房、紅豆杉散結(jié)消腫,共奏補(bǔ)肺散結(jié),化氣消痰,止咳平喘之功。

    表2 肺金生方對(duì)Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞VEGF-C、nm23蛋白表達(dá)的影響()

    表2 肺金生方對(duì)Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞VEGF-C、nm23蛋白表達(dá)的影響()

    注:與生理鹽水組比較,*P<0.05,**P<0.01;與CTX+中藥組比較,△P<0.01

    VEGF-C 被認(rèn)為在腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移中起著重要作用,具有促進(jìn)淋巴管、血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用,可通過(guò)促進(jìn)腫瘤新生淋巴管形成及淋巴管擴(kuò)張,并參與人體多種生理及病理過(guò)程[3]。nm23 基因是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因之一,nm23 基因引起許多哺乳類(lèi)動(dòng)物腫瘤細(xì)胞過(guò)于表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。若nm23缺失,可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)期存活[4]。本研究結(jié)果表明,中藥肺金生方各劑量組均能降低VEGF-C 表達(dá)(P<0.01、P<0.05),而中藥肺金生方中、高劑量組、CTX 加中藥組均能提高nm23的表達(dá)(P<0.01),中藥肺金生方中、高劑量組的nm23表達(dá)水平較CTX加中藥組更高(P<0.01)。本組結(jié)果表明肺金生方可以抑制Lewis 肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能與降低VEGF-C 表達(dá)和提高nm23的表達(dá)有關(guān),但其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

    [1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.第三次全國(guó)死因調(diào)查主要情況[J].中國(guó)腫瘤,2008,17(5):344-345.

    [2]周少玲,龐德湘.肺金生方治療肺虛痰阻型非小細(xì)胞肺癌29例臨床觀察[J].浙江中醫(yī)雜志,2008,43(6):328-329.

    [3]Hirakawa S,Lawence FB,Kodama S,et al.VEGF-C induced lym-phangiog-enesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metasis to distant sites[J].Blood,2007,109(2):1010-1017.

    [4]侯治富,楊紹娟.基因治療的研究概況[J].中國(guó)腫瘤臨床,1997,24(8):619.

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