高艷軍，楊清玲，陳昌杰，丁勇興

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室;3.蚌埠市中心醫(yī)院普外腫瘤科，安徽 蚌埠 233030)

腫瘤轉(zhuǎn)移是影響癌癥患者預(yù)后的重要因素之一，而轉(zhuǎn)移是由多個(gè)因素參與和多個(gè)步驟發(fā)展的過程。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子在為腫瘤細(xì)胞提供遷移信號，促進(jìn)其定向轉(zhuǎn)移并準(zhǔn)確定位中可能扮演著至關(guān)重要的角色。CXCR4(chemokine receptor 4、CXCR4 和CD184)屬G蛋白偶聯(lián)受體家族，與其配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor 1、SDF-1α 和CXCL12)構(gòu)成的生物學(xué)軸，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞趨化、轉(zhuǎn)移等諸多生物學(xué)效應(yīng)。CXCR4 抑制性多肽(N-terminal 21-mer peptide，NT21MP)是趨化因子巨噬細(xì)胞炎癥蛋白Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ，vMIP-Ⅱ)N端部分氨基酸序列，可以選擇性結(jié)合CXCR4 受體，通過競爭性結(jié)合CXCR4 活性位點(diǎn)降低CXCL12/CXCR4 信號軸的作用，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的趨化和轉(zhuǎn)移。雙分子熒光互補(bǔ)分析技術(shù)(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)是近年來出現(xiàn)的一種新技術(shù)，該技術(shù)可直觀地判斷目的蛋白在活細(xì)胞內(nèi)的定位及相互作用。本研究通過構(gòu)建NT21MP 和CXCR4 的BiFC 真核表達(dá)載體，求證二者在活細(xì)胞內(nèi)是否可以相互結(jié)合從而啟動(dòng)NT21MP 的生物學(xué)抑制效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞株SKBR3、非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞株COS-7、大腸桿菌DH5α 菌及JM109 菌為本實(shí)驗(yàn)室保存;pBiFC-VC155 載體、pBiFC-VN173 以 及 pBIFC-VN173-JUN 和pBIFC-VC155-FOS 陽性對照載體由美國普渡大學(xué)胡長燈教授惠贈(zèng);TRIzol 試劑購自Gibco 公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)購自Sigma 公司;cDNA 合成試劑盒購自Fermentas 公司;CXCR4引物、NT21MP 均由上海捷瑞公司合成;TaKaRa Ex Taq? PCR 擴(kuò)增試劑盒、限制性內(nèi)切酶、PMDTM-18T 載體、T4 DNA 連接酶及膠回收試劑盒均購自TaKaRa 公司;質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;退火緩沖液購自碧云天生物制劑公司。

1.2 方法

1.2.1 vMIPⅡN 端21 肽(NT21MP)目的基因的獲取 根據(jù)vMIP-ⅡN 端的氨基酸序列(Genbank:AAB62642)以及編碼vMIP-ⅡN 的開放閱讀框K4 基因(Genbank:U93872.2:21495 -21779)的核苷酸的序列確定了編碼vMIP-ⅡN 末端21個(gè)氨基酸肽的核苷酸序列作為目的基因。目的基因的兩端分別引入限制性內(nèi)切核酸酶KpnⅠ和EcoRⅠ的靶位序列，將設(shè)計(jì)好的2 條核苷酸序列由捷瑞生物工程有限公司合成。其核苷酸序列:A:5'-AATTCAGAT GCTGGGAGCGTCCTGGCATAGACCGGACAAGT GCTGTCTCGGTTACCAGAAAAGACCATTACCAG GTAC-3';B:5'-CTGGTAATGGTCTTTTCTGGTA ACCGAGACAGCACTTGTCCGGTCTATGCCAGGA CGCTCCCAGCATCTG-3'。首先用消毒的雙蒸水溶解2 條單鏈核苷酸至100μmol/L;然后，在PCR 反應(yīng)管中分別加入雙蒸水15μl、退火緩沖液5μl、寡核苷酸A 2.5μl 和寡核苷酸B 2.5μl，應(yīng)用PCR 儀進(jìn)行退火反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件:95℃變性2 min;每30 s 下降1℃，降至25℃;4℃保存。

1.2.2 pBiFC-VC155-NT21MP 的構(gòu)建與鑒定將pBiFC-VC155 質(zhì)粒載體用限制性核酸內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ在37℃雙酶切，電泳分離后純化回收。將已純化的酶切質(zhì)粒與NT21MP的退火產(chǎn)物于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。使用含氨芐西林(100 mg/L)的LB瓊脂平板篩選陽性克隆。抽提質(zhì)粒，以KpnⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定，酶切鑒定符合的克隆送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3 人類CXCR4 基因的PCR 擴(kuò)增 根據(jù)Genbank 中收錄的CXCR4 的mRNA 序列(NM_003467.2)，設(shè)計(jì)PCR 上游引物:5'-GGAATT CAATGGAGGGGATCAGTATATACAC-3'，設(shè) 有EcoRⅠ酶切位點(diǎn);下游引物:5'-GGGGTACCA AGCTGGAGTGAAAACTTGAAGACTCAGAC-3'，設(shè)有Kpn I 酶切位點(diǎn)。應(yīng)用Trizol 法提取乳腺癌SKBR3 細(xì)胞株中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后以該cDNA 為模板應(yīng)用上述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，66℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 人類CXCR4 基因的T 載體連接和鑒定PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，割膠回收目的片段，用試劑盒純化后與PMD18-T 載體連接(按試劑盒說明書進(jìn)行)。CaCl法轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細(xì)胞，篩選氨芐青霉素抗性克隆，抽提純化質(zhì)粒，重組質(zhì)粒PMD-18-T-CXCR4經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定后，委托生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.5 重組載體(pBiFC-VN173-CXCR4)的構(gòu)建與鑒定 測序正確的CXCR4-T 載體和pBiFC-VN173 載體分別應(yīng)用EcoRⅠ和KpnⅠ進(jìn)行酶切。將酶切后的目的基因與載體經(jīng)過割膠回收純化后經(jīng)T4 DNA 連接酶于16℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α 菌，使用含氨芐西林(100 mg/L)的LB 瓊脂平板篩選陽性克隆，抽提純化質(zhì)粒，以KpnⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定，酶切鑒定符合的克隆委托生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.6 重組載體共轉(zhuǎn)染COS-7 細(xì)胞 將COS-7 細(xì)胞接種于24 孔板，每孔10個(gè)細(xì)胞，于500μl 無抗生素DMEM 完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中37℃、5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%至90%且細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組:①pBIFC-VN173 和pBIFCVC155 共轉(zhuǎn)染組;②pBIFC-VN173-CXCR4 轉(zhuǎn)染組;③pBIFC-VC155-NT21MP 轉(zhuǎn)染組;④pBIFCVN173-CXCR4 和pBIFC-VC155-NT21MP 共轉(zhuǎn)染組;⑤pBIFC-VN173-JUN 和pBIFC-VC155-FOS 共轉(zhuǎn)染組(陽性對照)。取2 支EP 管，分別標(biāo)記為A 和B，各加入50μl 減血清培養(yǎng)液(OPTI-MEM)，A 管加入脂質(zhì)體2μl，混勻后室溫靜置5 min，B 管加入質(zhì)粒1μg(共轉(zhuǎn)染組每種0.5μg)，然后混勻A 和B 液，室溫靜置20 min，最后加入24 孔板中，37℃、5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 BiFC 重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-NT21MP 測序鑒定 將NT21MP 的DNA 與雙酶切后的pBiFC-VC155 質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性單克隆搖菌，取菌液送上海生工進(jìn)行基因測序。測序結(jié)果顯示，在測序序列的343 至420 位堿基為目的插入片段，與目的DNA 比對完全正確(圖1)，其插入方向及閱讀框架正確，證明BiFC 重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-NT21MP 構(gòu)建成功。

圖1 pBiFC-VC155-NT21MP 重組質(zhì)粒部分測序圖Fig.1 Partial sequencing results of recombinant plasmid pBiFC-VC155-NT21MP

2.2 RT-PCR 對人類CXCR4 擴(kuò)增 從乳腺癌SKBR細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后應(yīng)用上述CXCR4 引物擴(kuò)增后行瓊脂糖凝膠電泳。在約1 074 bp處有一明顯條帶，與預(yù)期的CXCR4 基因片段相符(圖2)。

圖2 CXCR4 基因PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of CXCR4 gene PCR products

2.3 PMD18-T-CXCR4 載體和BiFC 重組載體pBiFC-VN173-CXCR4 構(gòu)建與鑒定 CXCR4 的PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與PMD18-T 載體連接轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆搖菌，抽提質(zhì)粒。應(yīng)用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，切出約1 074 bp 和2.8 kb 大小的片段，同預(yù)期的長度和CXCR4 的PCR 結(jié)果均一致(圖3);同樣方法雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pBiFC-VN173-CXCR4，瓊脂糖電泳顯示約1 074 bp 和5.2 kb 的2 片段(圖4)。兩重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank 中收錄的人CXCR4 的編碼序列除+621 bp(ATG為1)處單個(gè)堿基突變(但不影響氨基酸的編碼)外，其余完全相同(圖5)，且插入方向及閱讀框架正確，說明BiFC 重組真核表達(dá)載體pBiFC-VN173-CXCR4 構(gòu)建成功。

圖3 PMD-18T-CXCR4 重組質(zhì)粒限制性酶切鑒定Fig.3 The restriction enzyme digestion analysis of PMD-18T-CXCR4 recombi-nant vector

2.4 CXCR4 和NT21MP 相互結(jié)合的BiFC 分析 用不同的質(zhì)粒單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染COS-7 細(xì)胞24 h后熒光顯微鏡觀察BiFC 信號(綠色)。圖6 示，在pBIFC-VN173 和pBIFC-VC155 共轉(zhuǎn)染組、pBIFC-VN173-CXCR4 轉(zhuǎn)染組及 pBIFCVC155-NT21MP 轉(zhuǎn)染組中均檢測不到BiFC 信號的表達(dá)，而在pBIFC-VN173-CXCR4/pBIFCVC155-NT21MP 共轉(zhuǎn)染組B和C中，可以檢測到BiFC 信號，且綠色熒光主要定位于胞質(zhì)內(nèi)。同樣在陽性對照B和C中也可以觀察到熒光。

圖4 pBiFC-VN173-CXCR4 重組質(zhì)粒限制性酶切Fig.4 The restriction enzyme digestion of pBiFC-VN173-CXCR4 recombinant vector

3 討論

趨化因子受體CXCR4(CD184)由Feng等于1996年發(fā)現(xiàn)的，其是一種結(jié)構(gòu)高度保守的7次跨膜受體，是G 蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員?；|(zhì)細(xì)胞來源因子1α(stromal cellderived factor 1，SDF-1α)又名CXCL12，其唯一受體為CXCR4。研究表明CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸對腫瘤的影響是多方面的，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［2，8-12］。

vMIP-ⅡN 端21 肽(NT21MP)是本室根據(jù)vMIP-ⅡN 端與CXCR4 結(jié)合的高度保守區(qū)，通過固相合成技術(shù)制備的活性多肽，能夠與CXCR4 特異性結(jié)合，在活性測定和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出高效的CXCR4 抑制活性。前期研究發(fā)現(xiàn)，NT21MP 能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的趨化及增殖，并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，其可能作用機(jī)制是NT21MP 通過與CXCL12 競爭結(jié)合于CXCR4，進(jìn)而抑制了CXCL12/CXCR4 的AKT、ERK等多種胞內(nèi)信號途徑的激活。但這些實(shí)驗(yàn)研究都是建立在體外實(shí)驗(yàn)和通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)間接測定的基礎(chǔ)之上，目前還沒有在活細(xì)胞內(nèi)直接觀察NT21MP 與CXCR4 相互作用的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。

圖5 pBiFC-VN173-CXCR4 重組質(zhì)粒部分測序圖Fig.5 Partial sequencing results of recombinant plasmid pBiFC-VC155-NT21MP

圖6 NT21MP 和CXCR4 在COS-7 細(xì)胞中的雙分子熒光互補(bǔ)分析圖Fig.6 BiFC analysis of NT21MP and CXCR4 in recombinant plasmid-transfected COS-7 cells

BiFC 技術(shù)是近年來由胡長燈教授首創(chuàng)的一種直觀、快速地判斷目的蛋白在細(xì)胞中定位和相互作用的新技術(shù)。Geoffrey 等研究發(fā)現(xiàn)，在GFP 的2個(gè)β 片層之間的環(huán)結(jié)構(gòu)上至少有10個(gè)位點(diǎn)可以插入外源蛋白而不影響GFP 的熒光活性。BiFC 技術(shù)正是利用該熒光蛋白家族的這一特性，在環(huán)結(jié)構(gòu)的特異位點(diǎn)將熒光蛋白切成N 端片段和C 端片段兩部分后，再由一小段氨基酸序列l(wèi)inker 分別與目標(biāo)蛋白連接。將重組好的基因構(gòu)建入載體，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，兩段重組基因在細(xì)胞中融合表達(dá)。若目標(biāo)蛋白間存在相互作用，通過linker 牽引熒光蛋白的N 端片段與C 端片段就能夠相互靠近，形成熒光蛋白生色團(tuán)重新發(fā)出熒光。該技術(shù)的關(guān)鍵是將擬觀察的目的蛋白的基因定向插入至相應(yīng)的真核表達(dá)載體。將構(gòu)建好的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下檢測是否有互補(bǔ)熒光產(chǎn)生，就可以推斷出兩目標(biāo)蛋白是否發(fā)生了相互作用。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了vMIP-ⅡN 端21 肽(NT21MP)和CXCR4 基因的BIFC 真核表達(dá)載體。在構(gòu)建的質(zhì)粒中，NT21MP 和CXCR4 編碼序列分別與Venus C 端155-238 位氨基酸殘基和N 端1-172 位氨基酸殘基的編碼序列片段連接。共轉(zhuǎn)染二者的重組質(zhì)粒，若NT21MP 和CXCR4 可以結(jié)合，二者在胞內(nèi)相互作用即可以使熒光蛋白重新恢復(fù)熒光活性。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用空BiFC 載體以及重組載體單獨(dú)和共轉(zhuǎn)染至COS-7 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h 后通過熒光顯微鏡觀察，在空載體共轉(zhuǎn)染以及重組質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染組中無BiFC 信 號，在 pBIFC-VN173-CXCR4/pBIFCVC155-NT21MP 共轉(zhuǎn)染組以及陽性對照組中則檢測到綠色熒光信號(圖6)。利用BiFC 技術(shù)觀察到二者在活細(xì)胞中的相互作用，這充分說明二者在胞內(nèi)可以相互結(jié)合;同時(shí)，為我們前期研究NT21MP 通過競爭性的結(jié)合受體CXCR4上的活性位點(diǎn)，CXCL12/CXCR4 生物軸的胞內(nèi)信號無法進(jìn)行有效激活，而進(jìn)一步抑制乳腺癌細(xì)胞株的趨化、增殖以及促進(jìn)凋亡的作用機(jī)制提供了一個(gè)有力的佐證。

腫瘤分子靶向治療是一種研究發(fā)現(xiàn)的新興腫瘤治療方法之一。CXCR4 參與多種疾病發(fā)生發(fā)展，為多種疾病的重要治療靶點(diǎn)，如艾滋病、腫瘤和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，尤其在腫瘤轉(zhuǎn)移方面。NT21MP 作為化學(xué)合成肽能夠直接作用于CXCR4 靶點(diǎn)，在本實(shí)驗(yàn)中得到了充分的證明，為NT21MP 向生物活性制劑靶向治療腫瘤轉(zhuǎn)移的研究方向的設(shè)想提供了理論支持。傳統(tǒng)的研究方法存在一定的缺陷:如免疫熒光的透化過程會(huì)對細(xì)胞造成損傷，而免疫共沉淀技術(shù)要求必須破碎細(xì)胞。它們都無法做到在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)、直接、快速地對細(xì)胞內(nèi)NT21MP 與CXCR4 間相互作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。BiFC 技術(shù)能彌補(bǔ)這一缺陷，并在研究轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用及其亞細(xì)胞定位，尋找G 蛋白可能存在相互作用的β 和γ 亞基，利用多色熒光互補(bǔ)技術(shù)同時(shí)檢測多種蛋白質(zhì)間的相互作用以及檢測泛素化途徑等相關(guān)生命科學(xué)領(lǐng)域中均得到具體應(yīng)用。

總之，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了應(yīng)用于BiFC 技術(shù)的真核表達(dá)載體，并且在活細(xì)胞內(nèi)檢測到NT21MP 與CXCR4 的互相結(jié)合，為進(jìn)一步研究NT21MP 通過CXCL12/CXCR4 軸發(fā)揮的受體拮抗作用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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