硫化氫預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

李 輝，冉 珂，唐正國，李雙鳳，常業(yè)恬

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院麻醉科，湖南 長沙 410011;2.長沙市第三醫(yī)院麻醉科，湖南 長沙 410015)

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)內(nèi)源性氣體信號分子，其參與機(jī)體許多生理和病理過程的調(diào)節(jié)。有研究表明，H2S 預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用［1］，但是其保護(hù)機(jī)制目前尚未完全闡明。S-腺苷蛋氨酸合成酶(SAM-s)是一種促進(jìn)高半胱氨酸合成的重要酶，而高半胱氨酸在體內(nèi)經(jīng)過氧化后可產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞損傷［2］。H2S 預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是否與SAM-s 有關(guān)目前未見報(bào)道。為此，本研究擬通過研究H2S 預(yù)處理對大鼠心肌SAM-s 表達(dá)的影響，以探討其對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康成年SD 雄性大鼠40 只，體重300～350 g，由湖南斯萊景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。

1.2 儀器設(shè)備 H150 呼吸機(jī)、MD100-2 電子分析天平、內(nèi)切式勻漿機(jī)、721 分光光度儀、恒溫水浴箱、恒溫震蕩器等系國產(chǎn)儀器;H-7500透射電子顯微鏡、CH30 光學(xué)顯微鏡、攝影系統(tǒng)、全自動生化分析儀、5415R 型高速低溫臺式離心機(jī)、壓力換能器、電轉(zhuǎn)印裝置、計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)系美國等國外公司產(chǎn)品。

1.3 試劑 硫氫化鈉(NaHS)、5-羥葵酸(5-HD)、伊文思藍(lán)、氯化硝基四氮唑藍(lán)、戊巴比妥鈉均為美國Sigma 公司產(chǎn)品，丙烯酰胺、無水乙醇、異丙醇、氯仿、二甲苯等均為國產(chǎn)試劑，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒均為南京建成生物工程研究所。

1.4 方法

1.4.1 缺血再灌注模型的制備 參考文獻(xiàn)［3-4］方法制備大鼠缺血再灌注模型，大鼠經(jīng)腹腔推注3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉，多導(dǎo)聯(lián)心電監(jiān)測。氣管插管，動物呼吸機(jī)控制呼吸，潮氣量8～10 ml/kg，頻率70次/min。在心尖搏動最明顯處之上一肋間隙開胸，切開心包，確認(rèn)左冠圓錐支，在圓錐支之后用7-0 絲線結(jié)扎左冠前降支，立即可見左室前壁紫紺充血，心率減慢，血壓一過性下降，心電圖監(jiān)測S-T 段明顯抬高，確認(rèn)阻斷成功。

1.4.2 動物分組 將40 只健康成年S-D 雄性大鼠隨機(jī)分成4組:假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(IR組)、硫化氫組(H組)和硫化氫預(yù)處理+線粒體KATP 通道阻斷劑(5-羥葵酸，5-HD)組(D組)，每組10 只。S組僅開胸并分離冠狀動脈左前降支，不阻斷血流150 min;IR組行冠狀動脈左前降支阻斷30 min，再灌注120 min;H組靜脈注射NaHS 0.05 mg/kg，給藥后24 h 同IR組處理，D組缺血前15 min 靜脈注射5-HD 5 mg/kg，其它同H組處理。

1.5 心肌梗死面積的測量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束立刻重新阻斷左冠前降支并從尾靜脈注入1%伊文思藍(lán)2 ml，充分染色后取出心臟。分離左心室(包括室間隔)，濾紙吸干后將心臟放在-20 ℃冰箱10 min 后取出，切片，每片厚約1～2 mm。血供正常心肌呈藍(lán)染，缺血區(qū)心肌呈紫紅或蒼白，缺血心肌與正常心肌比值即為缺血危險(xiǎn)區(qū)。將心肌置于37℃10%TTC 中水浴15 min，氧化還原反應(yīng)后存活心肌呈藍(lán)色，梗死心肌呈灰色，危險(xiǎn)區(qū)心肌呈紅色。4%甲醛固定24 h 后，每個(gè)心臟切片進(jìn)行數(shù)碼照相，留取左心室稱重。左心室，缺血區(qū)(非藍(lán)色區(qū))和心肌梗死區(qū)(灰色區(qū))面積用Image-Pro Plus 5.0 軟件計(jì)算。心肌缺血區(qū)范圍用心肌缺血區(qū)重量占左心室重量百分比表示。心肌梗死范圍用心肌梗死區(qū)重量占心肌缺血區(qū)重量百分比表示。

1.6 心肌SAM-s 的測定 采用免疫印跡分析，在再灌注120 min 結(jié)束即刻，取左心室前壁心肌組織提取蛋白，并于-70℃儲存?zhèn)溆?。?00μg 心肌蛋白于12.5%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，分離的心肌蛋白隨后通過電轉(zhuǎn)印裝置轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，室溫下在封閉液中作用3 h，再加入SAM-s 抗體，4℃孵育過夜，用TTBS 緩沖液沖洗15 min×4次后，加入二抗羊抗鼠IgG，室溫?fù)u動孵育1h，再用TTBS 緩沖液充分沖洗，最后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。結(jié)果用GIS-700D 型凝膠圖像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，記錄平均光密度值表示心肌SAM-s 表達(dá)。

1.7 生化指標(biāo)測定 于再灌注結(jié)束即刻抽取動脈血2 ml，以4 500 r/min 分離血清，-20℃保存待測。采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸鹽法分別測定血清丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將各組測得的值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用SPSS 13.0 軟件分析。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，多組均數(shù)的比較采用LSD法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死面積變化 除S組外，各組心肌缺血面積無明顯差異(P ＞0.05);與IR組比，H組心梗面積降低(P＜0.05)，D組無明顯差異(P ＞0.05，表1 和圖1)。

表1 各組大鼠心肌缺血面積及心梗面積的比較Table 1 The changes of infarct area and area at risk in each group(，n=7)

表1 各組大鼠心肌缺血面積及心梗面積的比較Table 1 The changes of infarct area and area at risk in each group(，n=7)

與IR組比，* P＜0.05.

圖1 大鼠左室心肌Evan's Blue 與TTC 染色后切片F(xiàn)ig.1 The slice of myocardium of the rat ventriculus sinister under staining of Evan's Blueand TTC

2.2 各組MDA 含量和SOD 活性的變化 與IR組比較，H組的SOD 活性升高，MDA 含量降低(P＜0.05)，而D組上述指標(biāo)與IR組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，表2)。與IR組比較，D組的SOD 活性和MDA 含量變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，表2)。

表2 各組大鼠血漿MDA 含量及SOD 活性的變化Table 2 Changes of plasma levels of MDA and SOD of each groups (，n=10)

表2 各組大鼠血漿MDA 含量及SOD 活性的變化Table 2 Changes of plasma levels of MDA and SOD of each groups (，n=10)

與IR組比較，* P＜0.05.

2.3 各組大鼠心肌SAM-s 表達(dá) 心肌SAM-s光密度值S組為(49.1±7.3)，表達(dá)水平較低;與S組比較，IR組(179.6±10.4)表達(dá)上升(P＜0.05);H組為(108.6±14.1)，表達(dá)低于IR組(P＜0.05)，D組為(188.5±12.8)，表達(dá)與IR組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠心肌SAM-s 蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot products of SAM-s expression of each group

3 討論

硫化氫(H2S)作為一種內(nèi)源性氣體信號分子，在體內(nèi)有兩種存在形式:1/3 以氣體形式，2/3 可能以硫氫化鈉(NaHS)形式存在。NaHS在體內(nèi)可解離成鈉離子和硫氫根離子，后者與體內(nèi)氫離子結(jié)合生成H2S，H2S 與NaHS 形成一種動態(tài)平衡。NaHS 溶液與內(nèi)源性H2S 的體內(nèi)的存在方式相似，而且NaHS 的濃度便于精確定量H2S 含量，而H2S 氣體飽和的液體則不便于精確定量H2S 的濃度，因此NaHS 溶液是較理想的外源性H2S 供體。Elrod 等［5］在研究H2S預(yù)處理對心肌損傷的保護(hù)機(jī)制中，發(fā)現(xiàn)從5～50μg/kg 不同劑量的NaHS 之中，50μg/kg的保護(hù)作用最強(qiáng)，因此，本研究采用IR 前24 h給予NaHS 50μg/kg 預(yù)處理的方案。

心肌梗塞面積是國際公認(rèn)的評價(jià)心肌缺血損傷的金指標(biāo)，TTC 染色法是公認(rèn)的檢測早期心肌細(xì)胞不可逆損傷的最可靠而靈敏的方法［6-7］。在本研究中，IR組和H組的缺血面積無顯著性差異，表明LAD 阻斷效果肯定，而且各組LAD 阻斷部位基本一致。與IR組比，H組心梗面積明顯降低，提示H2S 預(yù)處理能減輕心肌損傷程度。

SAM-s 合成酶是促進(jìn)高半胱氨酸合成的重要酶，SAM-s 在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成S-腺苷高半胱氨酸，后者進(jìn)一步脫去腺苷，生成高半胱氨酸。文獻(xiàn)報(bào)道，高半胱氨酸是糖尿病微血管病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2］，在糖尿病性心肌病大鼠心肌組織中的高表達(dá)是誘發(fā)加重糖尿病性心肌病發(fā)病的重要因素，這與細(xì)胞內(nèi)高半胱氨酸經(jīng)氧化產(chǎn)生大量氧自由基，引起血管內(nèi)皮損傷和功能障礙有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組心肌SAM-s 表達(dá)增高，提示缺血再灌注作為一種病理生理刺激因素，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化。另一方面，心肌缺血再灌注期間產(chǎn)生大量氧自由基是引起缺血再灌注損傷的的主要因素，其對心肌的損傷主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷［8-9］。Yang 等［10］證實(shí)，心肌缺血再灌注期間有大量氧自由基產(chǎn)生，而體內(nèi)最重要的脂質(zhì)過氧化作用的代謝產(chǎn)物是MDA，故測定MDA 能較好地反映組織脂質(zhì)過氧化程度，間接反映出細(xì)胞損傷程度［11］，SOD 是體內(nèi)清除自由基的一種特異酶，如果其活性降低，可導(dǎo)致氧自由基堆積，因此其活性變化可反映體內(nèi)抗氧化功能情況。本研究結(jié)果顯示，H2S 預(yù)處理組SAM-s 表達(dá)和MDA 含量降低，SOD 活性升高，提示H2S 預(yù)處理對心肌的保護(hù)作用可能是通過抑制S-腺苷蛋氨酸合成酶的表達(dá)，進(jìn)一步抑制高半胱氨酸在心肌內(nèi)的高表達(dá)，從而減少氧自由基的產(chǎn)生以及對心肌造成的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，H2S 預(yù)處理+線粒體KATP 通道阻斷劑組的心梗死面積、MDA 含量、SOD 活性以及心肌SAM-s 表達(dá)等指標(biāo)均無明顯變化，提示線粒體KATP通道介導(dǎo)了H2S 預(yù)處理對缺血再灌注心肌的保護(hù)作用。

總之，本研究表明，H2S 預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制心肌SAM-s 表達(dá)，減少氧自由基的生成，增強(qiáng)心肌抗氧化能力有關(guān)。

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