葛根芩連湯對2型糖尿病大鼠腎臟的量效關(guān)系研究

★ 張金蓮 張忠偉 王穎怡

（江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004）

葛根芩連湯出自張仲景所著的《傷寒論》，主治表證未解、邪熱入里證，有清泄里熱、解肌散邪之功。2型糖尿病是一種全球廣泛流行的代謝性疾病，表現(xiàn)為體內(nèi)胰島素相對不足、靶細(xì)胞對胰島素敏感性降低或患者產(chǎn)生的胰島素本身存在結(jié)構(gòu)上的缺陷。最終引起糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂[1]。實驗研究證實，此方可明顯降低正常小鼠及四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖，能減輕四氧嘧啶引起的氧自由基對胰島β細(xì)胞的損害[2]。高曉村等[3]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯合程氏萆薢分清飲加減湯劑能延緩濕熱型病的進(jìn)展，對糖尿病腎病有較可靠的療效。本研究旨在探討葛根芩連湯方劑量變化對2型糖尿病大鼠腎臟的治療作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠258只，雄性，體重120-150g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，動物合格證號：HNASLKJ20101144。于室溫，用標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼養(yǎng)籠分籠喂養(yǎng)，自由飲水。普通大鼠飼料購于江西中醫(yī)學(xué)院動物中心，高脂飼料是由上海斯萊克實驗動物有限公司加工（批號20101013042）。

1.2 實驗藥品

葛根芩連湯組成：葛根8g、黃芩3g、黃連3g、炙甘草2g。實驗用藥由江西中醫(yī)學(xué)院國家工程研究中心提供。鹽酸二甲雙胍：0.25g/片，批號：20100601、20101001，深圳海王藥業(yè)有限公司。STZ（（streptozotoein，鏈脲佐菌素）：北京夏斯康特生物技術(shù)中心分裝Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 主要試劑

檸檬酸（核工業(yè)實驗化工廠，分析純）；檸檬酸三鈉（核工業(yè)實驗化工廠，分析純）；DEPC（焦炭酸二乙脂）（北京索萊寶科技有限公司，高級純）；氫氧化鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純，批號20060120）；氯化鈉（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，分析純，批號20100408）；葡萄糖（西隴化工股份有限公司，分析純，批號：1005291）；EDTA-K2（乙二胺四乙酸二鉀）（上海試劑一廠，分析純，批號：20080904）；無水乙醇（上海振興化工一廠，分析純，批號：200909265和201104302）；乙醚（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號：20101206）；苦味酸（臺山市化工廠有限公司，分析純，批號：2009120）。

1.4 實驗試劑盒和儀器

1.4.1 主要實驗儀器 GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SZ-97A自動三重純水蒸流器（上海亞榮生化儀器廠）；TL-5.0W臺式離心機（上海市離心機械研究所）；PHS-3C精密pH計（上海虹益儀器儀表有限公司）；EH5246電吹風(fēng)（松下電工-萬寶電器廣州有限公司）；UV-3100PC紫外分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；穩(wěn)步型血糖儀（L6159RB01021）（強生（中國）醫(yī)療器械有限公司）；10mL注射器（型號100626）（江西三鑫醫(yī)療器械集團有限公司）；強生穩(wěn)步型血糖試紙（批號：3075149008、3074021004）強生（中國）醫(yī)療器械有限公司；2.5mL注射器（型號100630）（江西三鑫醫(yī)療器械集團有限公司）；1mL注射器（型號100518）（江西三鑫醫(yī)療器械集團有限公司）；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BS224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；真空采血管（批號：091228）（江西省容和實業(yè)有限公司）；真空采血管（批號：100708）（江西省容和實業(yè)有限公司）。

1.4.2 試劑盒 血肌酐（Cr）（生產(chǎn)廠家：南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20110621）；尿素氮（BUN）（生產(chǎn)廠家：南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20110613）。

2 實驗方法

2.1 適應(yīng)性喂養(yǎng)

SPF級SD大鼠258只，于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。觀察大鼠適應(yīng)情況。

2.2 造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分出正常組大鼠12只，除正常組給予普通飼料外，其余大鼠全部給予高脂飼料，自由飲水。高脂飼料喂養(yǎng)1個月，造模前所有大鼠禁食不禁水16小時，按30mg/kg的劑量給高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素溶液，正常組大鼠注射等體積檸檬酸緩沖液，注射2小時后，每只大鼠灌胃葡萄糖溶液4mL，并在平時飲水中酌情添加葡萄糖。注射后所有大鼠均喂食普通飼料，72小時后尾靜脈取血，用血糖儀檢測空腹血糖，再1周后同樣方法檢測血糖，兩次血糖值均大于11.1mmol/L者，視為造模成功，共180只。將造模成功的大鼠按血糖值隨機分為11個組，分別為模型組、陽性組（二甲雙胍）、葛根芩連湯原方劑量組、葛根芩連湯3倍原方劑量組、葛根芩連湯5倍原方劑量組、葛根芩連湯7倍原方劑量組、葛根芩連湯9倍原方劑量組、葛根芩連湯11倍原方劑量組、葛根芩連湯13倍原方劑量組、葛根芩連湯15倍原方劑量組、葛根芩連湯17倍原方劑量組，再加正常組共分為12各組別。各組自由飲水，各組大鼠均喂食普通高壓滅菌飼料，每天換大鼠墊料，并觀察大鼠活動狀態(tài)，毛色等，并記錄死亡情況。

2.3 給予葛根芩連湯治療

分組后，通過成人用量換算到大鼠給藥量，給藥組按體重灌胃葛根芩連湯，葛根芩連湯分別以1.65、4.95、8.25、11.55、14.85、18.15、21.45、24.75、28.05g飲片/kg給藥，陽性藥組灌胃200mg/kg/d的劑量的鹽酸二甲雙胍溶液，正常組和模型組給予相同體積的蒸餾水，連續(xù)給藥至12周末。實驗期間每周測體重1次，測血糖1次。給予充足的高壓滅菌后的水及普通飼料，每天換墊料，每周清洗籠具及水瓶1次并高壓滅菌。

2.4 動物處理

實驗結(jié)束后，大鼠禁食12小時，不禁水，稱量大鼠體重，乙醚麻醉，心尖取血，取血清，檢測相應(yīng)指標(biāo)。每組大鼠取血后，取出腎臟并稱重量。

2.5 檢測指標(biāo)及其方法

2.5.1 臟器指數(shù) 稱取各大鼠的腎臟重量（g），臟器指數(shù)=臟器重量/大鼠體重×100%。

2.5.2 血清肌酐、尿素氮檢測 血肌酐：檢測方法：除蛋白法，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。尿素氮：檢測方法：尿酶法，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用spss17.0統(tǒng)計軟件處理，實驗數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以雙側(cè)P＜0.05或者P＜0.01為有統(tǒng)計學(xué)意義，量效關(guān)系曲線擬合由SPSS17.0統(tǒng)計軟件完成。

表1 葛根芩連湯對糖尿病大鼠臟器指數(shù)、血肌酐、尿素氮的量效表（±s）

表1 葛根芩連湯對糖尿病大鼠臟器指數(shù)、血肌酐、尿素氮的量效表（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01，**P＜0.05

組別正常組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯劑量/g?kg-1- -0.2 1.65 4.95 8.25 11.55 14.85 18.15 21.45 24.75 28.05 n 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8臟器指數(shù)(%)0.57±0.066 1.34±0.111#1.12±0.067*1.20±0.124*1.20±0.109*1.18±0.112*1.18±0.126*1.14±0.181*1.15±0.098*1.06±0.076*1.08±0.087*1.11±0.099*肌酐濃度(μmol/L)266.49±86.01 537.96±116.94#389.77±74.79*249.40±55.68*304.75±88.20*209.62±53.59*242.14±93.68*183.68±80.32*141.13±41.61*199.59±22.68*247.87±49.40*162.92±67.30*尿素氮濃度(mmol/L)6.90±0.83 17.08±2.46#15.43±1.00 14.19±1.60**15.96±3.13 15.44±1.30 14.25±2.14**12.94±2.48*12.47±2.59*12.03±1.18*11.10±2.15*13.39±1.44*

3 結(jié)果

3.1 臟器指數(shù)及血肌酐、尿素氮水平數(shù)據(jù)表

3.2 數(shù)據(jù)擬合后的量效關(guān)系曲線

3.2.1 腎臟臟器指數(shù)量效關(guān)系曲線

圖1 葛根芩連湯與腎臟臟器指數(shù)量效關(guān)系

由方程式和圖1分析，表明葛根芩連湯給藥劑量在1.65g飲片/kg-28.05g飲片/kg之間時，隨著劑量的增大，臟器指數(shù)減?。ㄐ?yīng)增強）。

3.2.2 血肌酐和尿素氮

圖2 葛根芩連湯與血肌酐含量的量效關(guān)系

由方程式和圖2分析，表明隨著葛根芩連湯給藥劑量的增大，血肌酐含量降低（效應(yīng)增強）。

圖3 葛根芩連湯與血尿素氮含量的量效關(guān)系

由曲線方程式與圖3分析，表明葛根芩連湯在1.65g飲片/kg-28.05g飲片/kg劑量之間，趨勢為隨著劑量的增大，血尿素氮含量降低（效應(yīng)增強）。

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)已經(jīng)證明，葛根芩連湯方中各藥均有不同程度的降糖和（或）改善糖尿病慢性并發(fā)癥的藥理作用。趙林華等[4]取葛根芩連湯清熱化濕、生津潤燥的功效，用于糖尿病濕熱證及其并發(fā)癥的治療，降糖作用明顯，療效肯定。曾藝鵬等[5]發(fā)現(xiàn)對伴有濕熱證的2型糖尿病患者，在短期胰島素強化治療的基礎(chǔ)上，聯(lián)合葛根芩連湯加味治療，可以相對減少胰島素用量，并取得較好的臨床療效。提示葛根芩連湯在改善糖尿病患者濕熱證的過程中，對減輕2型糖尿病患者胰島素抵抗，促進(jìn)胰腺β細(xì)胞的功能恢復(fù)上有幫助。

大鼠的臟器指數(shù)是指大鼠的臟器重量與大鼠體重的比值?？梢暂^為客觀的指示臟器的病變狀態(tài)。本實驗結(jié)果表明葛根芩連湯可以較為明顯的降低腎臟臟器指數(shù)，其中在14.85g飲片/kg-21.45 g飲片/kg劑量之間對肝臟臟器指數(shù)的下降有明顯的量效關(guān)系；在4.95g飲片/kg-21.45g飲片/kg劑量之間對于腎臟的臟器指數(shù)改善有明顯的量效關(guān)系。

血肌酐是人體肌肉代謝的產(chǎn)物，肌酐主要通過不可逆的非酶脫水反應(yīng)緩慢地生成肌酐，再釋放到血液中隨尿液排泄掉，因此血肌酐與人體的肌肉總量關(guān)系密切，基本上不受飲食，分解代謝等腎外因素的影響，在外源性肌酐攝入量穩(wěn)定及體內(nèi)生成量恒定的情況下，血肌酐的濃度主要取決于腎小球濾過功能的影響。血尿素氮是人體蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物，尿素氮的含量與腎小球的濾過功能也有較大的關(guān)系。

臨床上2型糖尿病患者的并發(fā)癥較多，如糖尿病腎病、糖尿病足病、糖尿病腦病等。血清尿素氮和血肌酐的含量是腎功能較為主要的兩個指標(biāo)，具有重要參考意義。本實驗經(jīng)過初步研究，表明葛根芩連湯可以較為明顯的降低血清肌酐和尿素氮的含量。在4.95g飲片/kg-21.45 g飲片/kg劑量之間對于血肌酐含量下降有明顯的量效關(guān)系，經(jīng)過曲線擬合表明葛根芩連湯方劑量變化與血肌酐含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，即劑量增加，效應(yīng)增強。經(jīng)過曲線擬合表明葛根芩連湯方劑量變化與血尿素氮的含量呈現(xiàn)多波折的量效關(guān)系，葛根芩連湯在8.25g飲片/kg-21.45g飲片/kg劑量之間，趨勢為隨著劑量的增大，效應(yīng)增強。提示葛根芩連湯對糖尿病腎病的改善有一定的幫助作用。

通過對血尿素氮等指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合得到最佳劑量范圍大致處于18.15g飲片/kg-24.15g飲片/kg，對應(yīng)于原方相當(dāng)于1兩=13g-15g之間，這個研究結(jié)果與目前大多數(shù)學(xué)者關(guān)于經(jīng)方用藥中“兩”的量值認(rèn)識情況較吻合。

[1]朱禧星，楊永年，沈稚舟.現(xiàn)代糖尿病學(xué)[M].上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，2000.

[2]潘競鏗，韓超，劉惠純.葛根芩連湯降血糖作用的實驗研究[J].中國新藥雜志，2000，9（3）：167.

[3]高曉村.葛根芩連湯合程氏萆薢分清飲加減治療濕熱型糖尿病腎病的療效觀察[J].北京中醫(yī)藥，2009，28（9）：718-719.

[4]趙林華，仝小林，連鳳梅，等.經(jīng)方葛根芩連湯治療糖尿病及其并發(fā)癥初探[C].第四屆國際中醫(yī)糖尿病大會論文匯編，2009：352.

[5]曾藝鵬，黃云勝，胡蘊剛，等.葛根芩連湯配合胰島素強化治療濕熱證2型糖尿病臨床觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（6）：514.