枯草桿菌芽孢皮層裂解酶的分離純化以及酶學(xué)結(jié)構(gòu)分析

曾朝瑋,孫 靜,馬慧嬌,郭家俊,郭洪偉,章 中

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

芽孢是某些細(xì)菌在生長(zhǎng)發(fā)育到一定階段后,在其細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形或橢圓形的休眠體,對(duì)殺菌處理具有極端抗性,是引起食品安全問題和食品腐敗的原因之一[1-5]。芽孢萌發(fā)后其極端抗性消失。芽孢皮層裂解酶是芽孢內(nèi)唯一水解芽孢皮層肽聚糖的酶[6],芽孢萌發(fā)過程中皮層裂解酶被激活并將芽孢皮層水解可致使芽孢核心完全水化。許多因素都能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā),如溶菌酶、十二烷胺等陽離子表面活性劑、嘌呤核苷類物質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、細(xì)胞壁碎片等等[7-8]。

高壓熱殺菌技術(shù)(HPTS)將超高壓和溫度協(xié)同起來,能有效殺滅細(xì)菌芽孢,并有利于保持食品的風(fēng)味、顏色、質(zhì)地以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9-12],但是HPTS殺滅芽孢的機(jī)理尚不明確。有報(bào)道推測(cè)在一定的壓力和溫度條件下,皮層裂解酶可能被激活,導(dǎo)致芽孢皮層肽聚糖水解,進(jìn)而使得芽孢結(jié)構(gòu)被破壞而死亡[13]。因此,研究HPTS對(duì)芽孢皮層裂解酶的作用具有重要意義,而要研究HPTS是否能激活芽孢皮層裂解酶,首先要從枯草芽孢桿菌皮層裂解酶粗酶液中分離純化出皮層裂解酶,然后對(duì)皮層裂解酶進(jìn)行HPTS處理,闡明HPTS對(duì)皮層裂解酶活性和結(jié)構(gòu)的影響,進(jìn)而揭示HPTS殺滅芽孢的機(jī)理。微生物酶常見的分離純化方法有鹽析、離子交換層析、凝膠過濾、疏水層析和親和層析[14]。單一的分離方法難以達(dá)到理想的分離效果,因此往往需要兩種或兩種以上的分離方法才能達(dá)到分離純化的目的,而分離次序的選擇又影響最大純化倍數(shù)和和回收率以及酶活力。

本實(shí)驗(yàn)采用透析法、硫酸銨分級(jí)沉淀、SP-sephadex C-25離子交換層析及Superdex 75凝膠過濾層析對(duì)皮層裂解酶進(jìn)行分離純化,并在每一步純化操作結(jié)束后對(duì)皮層裂解酶的活性及總蛋白含量進(jìn)行測(cè)定,使用SDS-PAGE電泳分析測(cè)定其分子量,建立適用于分離純化枯草桿菌芽孢皮層裂解酶的實(shí)驗(yàn)條件,為研究HPTS對(duì)皮層裂解酶的作用提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),編號(hào)As 1.433;促芽孢生長(zhǎng)錳鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:向普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入MnSO4·H2O(使得培養(yǎng)基中Mn2+的濃度為50 mg/L),調(diào)pH至7,滅菌,備用;30%丙烯酰胺溶液 北京雷根生物科技有限公司;pH=8.8的4×Tris/SDS分離膠緩沖液,pH=6.8的4×Tris/SDS濃縮膠緩沖液 上海雙螺旋生物科技有限公司;2,6-吡啶二羧酸(DPA) 分析純,美國(guó)Sigma公司;透析液:1 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、1 mmol/L的巰基乙酸鈉的磷酸鈉緩沖液(濃度75 mmol/L、pH=7.0);L-丙氨酸、肌苷 上海瑞永生物科技有限公司;TEMED、甘氨酸 北京博奧拓達(dá)科技有限公司;寬范圍預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 美國(guó)Thermo Scientific;牛血清白蛋白 北京酷爾化學(xué)科技有限公司;SP-sephadex C-25、Superdex 75 GE生命科學(xué);考馬斯亮藍(lán)R-250 上海翊圣生物科技有限公司;5×蛋白質(zhì)電泳緩沖液:Tris 15.1 g,甘氨酸94 g,SDS 5 g,用蒸餾水定容至1000 mL,使用時(shí)用蒸餾水稀釋5倍;其它化學(xué)試劑 均為分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

DYCZ-24DN型電泳槽 北京六一生物科技有限公司;DYY-6C型電泳儀電源 北京市六一儀器廠;XH-T型渦旋混合器 金壇區(qū)金城碩華儀器廠;DHL-B型電腦恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;BS-100N型自動(dòng)部分收集器 上海青浦滬西儀器廠;TH-1000A型梯度混合器 上海青浦滬西儀器廠;UV-2450型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;Agilent 1100型HPLC色譜儀及數(shù)據(jù)處理平臺(tái) 美國(guó)Agilent公司;970CRT型熒光分光光度計(jì) 杭州匯爾儀器公司;Welch Ultimate AQ-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國(guó)Welch公司;Spectrum Two型傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芽孢懸浮液的制備 芽孢的制備參照Gao等[15]的方法,將活化(挑一環(huán)菌液在滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管斜面上進(jìn)行劃線培養(yǎng),37 ℃條件下培養(yǎng)7 d,重復(fù)3次)的枯草芽孢桿菌接入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,在滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管斜面上進(jìn)行劃線培養(yǎng),在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d,將試管斜面上的芽孢用無菌去離子水振蕩洗滌下來,收集到離心管里,然后用無菌去離子水離心洗滌(4 ℃、8000 r/min、15 min)芽孢3次,洗滌后的芽孢重懸在無菌去離子水中,離心濃縮(8000 r/min、15 min),測(cè)定吸光度,調(diào)節(jié)芽孢濃度約為1.5×109CFU/mL,4 ℃保存,一個(gè)月內(nèi)使用。每次使用前要將芽孢用無菌去離子水再次洗滌(4 ℃、8000 r/min、15 min)。

1.2.2 枯草桿菌芽孢萌發(fā)處理 萌發(fā)處理參照Miyata等[16]和Makino等[17]的方法。將枯草桿菌芽孢懸浮液(0.1 g/mL)在65 ℃下熱激活45 min,然后在冰水浴中冷卻至室溫,再經(jīng)離心(8000 r/min、4 ℃、15 min)沉淀后,將芽孢置于10倍體積的、pH=7.0的、30 mmol/L的磷酸鈉緩沖液中,于32 ℃下萌發(fā),磷酸鈉緩沖液中含有10 mmol/L的L-丙氨酸和4 mmol/L的肌苷。

1.2.3 芽孢皮層裂解酶粗酶液的提取 參照Gombas等[18]和Makino等[17]的方法提取芽孢皮層裂解酶粗酶液,并對(duì)該方法稍作修改,芽孢萌發(fā)后,進(jìn)行離心處理(8000 r/min,4 ℃,15 min),將上清粗酶液移入8000 Da的透析袋中于4 ℃冰箱中透析48 h,期間24 h更換一次透析液。

1.2.4 芽孢皮層裂解酶粗酶液DPA測(cè)定 使用RP-HPLC法檢測(cè)DPA。DPA檢測(cè)參照Fichtel等[20]的方法。使用C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)進(jìn)行檢測(cè),柱溫設(shè)定為30 ℃,進(jìn)樣量為10 μL,洗脫條件為20%的甲醇和80%濃度為50 mmol/L的磷酸氫鈉溶液,pH=2.5,流速為1.0 mL/min。

1.2.5 脫芽孢衣芽孢的制備 脫芽孢衣芽孢的制備是通過對(duì)Gombas等[18]和Makino等[17]的方法稍作修改而完成的,用pH為10.0,濃度為0.1 mol/L的硼酸鹽緩沖液在40 ℃處理枯草芽孢桿菌芽孢,緩沖液中含有30 mmol/L十二烷基硫酸鈉、0.2 mol/L 2-巰基乙醇,8 h后再用蒸餾水離心(8000 r/min,4 ℃,15 min)洗滌干凈。

1.2.6 芽孢皮層裂解酶活性測(cè)定 酶活性分析方法參照Makino等[17]和Miyata等[16]的方法,皮層裂解酶可以水解芽孢皮層肽聚糖,具有專一性,芽孢皮層肽聚糖被水解后,會(huì)導(dǎo)致脫芽孢衣芽孢懸浮液OD600值顯著下降,酶活性越高,OD600值下降的程度則越大,因此脫芽孢衣芽孢懸浮液OD600值的變化可用于評(píng)價(jià)皮層裂解酶的活性。酶活性單位定義參考周磊等[19]的方法,并做了部分修改。在32 ℃下,向4 mL透析后的皮層裂解酶中加入1 mL濃度為1.5×107CFU/mL的脫芽孢衣芽孢懸浮液,反應(yīng)酶液包含0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液、1 mmol/L的EDTA和1 mmol/L的巰基乙酸鈉,pH為7.0。對(duì)照組為4 mL無菌水中加入1 mL濃度為1.5×107CFU/mL的脫芽孢衣芽孢懸浮液,酶的活性通過脫芽孢衣芽孢懸浮液的OD600值的減少量來測(cè)定。每分鐘OD600值降低0.001所需的酶量為一個(gè)活性單位。根據(jù)以下公式計(jì)算酶活:

式中:X為酶活(U/L),V為參與反應(yīng)的酶量(mL),t為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.2.7 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。配制1 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液(準(zhǔn)確稱取100 mg牛血清蛋白,用20 mmol/L、pH=6.5的磷酸緩沖溶液定容至100 mL),取7支試管,依次加入0、20、40、60、80、100和120 μL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后用磷酸緩沖液將各管中蛋白母液體積補(bǔ)充至1 mL,再向各管中加入2.5 mL考馬斯亮藍(lán)染色液,渦旋振蕩混勻,室溫放置2 min后在595 nm下測(cè)定吸光度值,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo),以吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,并得出回歸方程。

1.2.8 芽孢皮層裂解酶粗酶液的分離純化

1.2.8.1 硫酸銨分級(jí)沉淀 硫酸銨分級(jí)沉淀參照文獻(xiàn)[21-22]的方法,分別將粗酶液中硫酸銨飽和度調(diào)節(jié)為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%,在加入硫酸銨時(shí),為防止硫酸銨局部濃度過高,要邊加邊進(jìn)行混勻,加完后繼續(xù)渦旋振蕩混勻20 min,以使硫酸銨充分溶解;于4 ℃冰箱中靜置12 h后冷凍離心(8000 r/min,30 min),將沉淀收集并溶解于磷酸鈉緩沖液中,測(cè)定各飽和度下皮層裂解酶活力和蛋白含量,得到酶活力較高的區(qū)間。

1.2.8.2 SP-sephadex C-25離子交換層析 參照Makino等[17]和Ando等[23]的方法,并作相應(yīng)的修改,經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀處理后的酶液經(jīng)脫鹽濃縮后用SP-sephadex C-25柱(1.5 cm×15 cm)處理,首先要將該柱進(jìn)行平衡,平衡條件為:用250 mL、75 mmol/L、pH=7.0的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行平衡,緩沖液中含有1 mmol/L的EDTA、1 mmol/L的巰基乙酸鈉(緩沖液A),流速為1.5 mL/min;平衡后上樣,再用洗脫液在常溫下洗脫,洗脫條件為:用含有線性梯度NaCl(洗脫過程中NaCl濃度由0逐漸增大至1.2 mol/L)的緩沖液A進(jìn)行洗脫,洗脫速度控制在0.5 mL/min。洗脫結(jié)束后在220 nm下測(cè)定各管洗脫液的吸光度值,將含有皮層裂解酶的組分收集起來。

1.2.8.3 Superdex 75凝膠過濾洗脫 將收集起來的皮層裂解酶進(jìn)行脫鹽濃縮,立即用Superdex 75凝膠柱(2.6 cm×15 cm)在常溫處理。首先要將該柱進(jìn)行平衡,平衡條件為:先用250 mL緩沖液A平衡,再用150 mL、含0.4 mol/L氯化鈉的緩沖液A進(jìn)行平衡處理,流速均為1.5 mL/min;平衡后的柱子在常溫下放置1 h后進(jìn)行上樣、洗脫,洗脫條件為:用200 mL含有0.2 mol/L氯化鈉的緩沖液A進(jìn)行洗脫以分離出皮層裂解酶,洗脫速度控制在0.5 mL/min。洗脫結(jié)束后,各組分(每管3.5 mL)被收集起來并在220 nm下測(cè)定各管洗脫液的吸光度值,將含有皮層裂解酶的組分收集起來,于4 ℃透析處理24 h,透析對(duì)照液為1 L的75 mmol/L的、pH=6.5的磷酸鈉緩沖液(緩沖液B)。

1.2.9 芽孢皮層裂解酶SDS-PAGE凝膠電泳 SDS-PAGE參考郭堯君等[24]的方法。選擇10%的分離膠及5%的濃縮膠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),上樣量為10 μL。電泳過程中,樣品在濃縮膠中時(shí)調(diào)節(jié)電壓為75 V,樣品遷移至分離膠中調(diào)節(jié)電壓為120 V,當(dāng)樣品條帶遷移至距凝膠底端1 cm左右時(shí),停止電泳,取出凝膠板,然后對(duì)分離膠進(jìn)行過夜染色(考馬斯亮藍(lán)R-250 1 g,乙醇45%,冰乙酸10%,加水定容至1000 mL,過濾后使用),之后用水將凝膠漂洗幾遍,用脫色液(冰乙酸10%,乙醇30%)進(jìn)行脫色,每3 h換一次脫色液,脫色至能清楚顯示出蛋白條帶為止。

表1 10%分離膠和5%的濃縮膠的配制Table 1 Preparation of 10% separation glue and 5% concentrated glue

1.2.10 枯草桿菌皮層裂解酶的結(jié)構(gòu)分析

1.2.10.1 樣品制備 將分離純化出的皮層裂解酶(酶液中磷酸鈉濃度為0.05 mol/L)使用10 kDa的超濾離心管進(jìn)行濃縮、脫鹽。然后將皮層裂解酶樣品進(jìn)行真空冷凍干燥成粉末狀,放在4 ℃冰箱保存。

1.2.10.2 枯草桿菌皮層裂解酶的傅里葉紅外光譜掃描及圖譜分析 采用傅立葉變換紅外光譜儀對(duì)皮層裂解酶進(jìn)行光譜采集。稱取2 mg的樣品在瑪瑙研缽中磨成細(xì)粉,再與干燥的溴化鉀粉末(100 mg,粒度200目)混合均勻,裝入模具內(nèi),在壓片機(jī)上壓制成片測(cè)試。測(cè)定樣品在4000～400 cm-1波譜數(shù)的吸收光譜,掃描溫度為(35±0.2) ℃,分辨率為4 cm-1。圖譜處理參考Byler等[25]的方法。利用PeakFitv4.12軟件在譜帶范圍內(nèi)(酰胺Ⅰ帶1600～1700 cm-1)校正基線,然后用Gaussian去卷積,做二階導(dǎo)數(shù)擬合,多次擬合使殘差最小。根據(jù)峰的面積,計(jì)算出枯草桿菌芽孢皮層裂解酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢皮層裂解酶粗酶液DPA測(cè)定

芽孢萌發(fā)的關(guān)鍵是芽孢內(nèi)源DPA的釋放,而皮層裂解酶能誘導(dǎo)脫芽孢衣芽胞萌發(fā)并釋放DPA[1]。為確定所提取到的粗酶液中確實(shí)含有皮層裂解酶,將皮層裂解酶粗酶液與脫芽孢衣芽孢懸浮液混合,然后將樣品混合液進(jìn)行RP-HPLC分析。結(jié)果如圖1所示,由圖1可以看出,DPA標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時(shí)間為4.64 min,樣品混合液在4.65 min時(shí)有峰出現(xiàn),這個(gè)出峰時(shí)間與DPA的出峰時(shí)間相符,說明脫芽孢衣芽孢被皮層裂解酶誘導(dǎo)萌發(fā),并且釋放出了DPA。

圖1 反相高效液相色譜圖。Fig.1 Reversed-phase high performance liquid chromatography 注:(a)DPA標(biāo)液；(b)樣品混合液。

2.2 芽孢皮層裂解酶粗酶液硫酸銨分級(jí)沉淀試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖2,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=8.457x-0.003,計(jì)算出經(jīng)硫酸銨鹽析所得沉淀的蛋白濃度,再對(duì)各硫酸銨濃度下所沉淀出的皮層裂解酶活力進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出,隨著硫酸銨濃度的不斷增大,總蛋白含量和皮層裂解酶活力都逐漸增大,使用40%的硫酸銨進(jìn)行沉淀時(shí),總蛋白濃度為0.075 mg/mL,酶活為102.08 U/L;當(dāng)硫酸銨濃度增大至60%時(shí),此時(shí)大部分皮層裂解酶被聚集沉淀下來,總蛋白濃度(0.086 mg/mL)及皮層裂解酶活力(292.71 U/L)都達(dá)到最大值。繼續(xù)增大硫酸銨飽和度至70%、80%時(shí),酶活力均有所降低,蛋白濃度有所降低,說明在此飽和度下所沉淀下來的蛋白大部分為雜蛋白。為盡可能減少雜蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾以及簡(jiǎn)化后期的分離工作,本實(shí)驗(yàn)選取40%～60%硫酸銨飽和度用于皮層裂解酶的分離純化。

圖2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of bovine serum

圖3 芽孢皮層裂解酶粗酶液硫酸銨分級(jí)沉淀Fig.3 Ammonium sulfate fractionation precipitation of the crude cortex-lytic enzyme

2.3 枯草桿菌芽孢皮層裂解酶粗酶液SP-sephadex C-25離子交換層析

枯草桿菌芽孢皮層裂解酶經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀后,再經(jīng)SP-sephadex C-25離子交換層析,對(duì)皮層裂解酶的洗脫結(jié)果進(jìn)行作圖。結(jié)果如圖4所示,圖中峰1為NaCl濃度在0.1～0.2 mol/L時(shí)所出現(xiàn)的洗脫峰,經(jīng)皮層裂解酶活性測(cè)定,OD600處吸光度值下降,確定該峰為目的蛋白峰。峰2為NaCl濃度在0.3～0.4 mol/L時(shí)所出現(xiàn)的洗脫峰,經(jīng)檢測(cè)確定該峰為雜蛋白峰。將酶活性較高的幾管收集起來進(jìn)行超濾離心,對(duì)收集到的皮層裂解酶進(jìn)行脫鹽濃縮,最終將酶液濃縮至4 mL左右。對(duì)該純化步驟前后的皮層裂解酶進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果見圖5。

圖4 皮層裂解酶SP-sephadex C-25離子交換層析圖Fig.4 Elution curve of cortex-lytic enzyme by SP-sephadex C-25 chromatography注:a.NaCl洗脫濃度;b.枯草桿菌皮層裂解酶隨NaCl洗脫濃度變化曲線。

圖5 皮層裂解酶SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis of spore cortex-lytic enzymes注:(a)未經(jīng)純化的皮層裂解酶;(b)經(jīng)SP-sephadexC-25離子交換層析的皮層裂解酶。

如圖5所示為皮層裂解酶SDS-PAGE圖,且每個(gè)泳道均為15 μL的枯草桿菌皮層裂解酶粗酶液。由圖5(a)可見,未經(jīng)SP-sephadex C-25離子交換層析的皮層裂解酶中雜蛋白種類很多,而且很多雜蛋白較為密集,且分子量大小較為相似,而經(jīng)SP-sephadex C-25離子交換柱層析后的皮層裂解酶粗酶液中大部分雜蛋白被分離,但是目的蛋白里面仍有一些雜蛋白條帶,說明這些雜蛋白與目的蛋白的離子強(qiáng)度相近,使用離子交換柱無法將其完全分離。但從圖5(b)可以看出,經(jīng)SP-sephadex C-25離子交換柱層析純化后,各蛋白條帶的分子量差異明顯,因此選擇Superdex 75凝膠過濾法,根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小對(duì)酶液進(jìn)一步純化。

2.4 枯草桿菌芽孢皮層裂解酶粗酶液Superdex 75凝膠過濾

由圖6看出,經(jīng)SP-sephadex C-25離子交換層析后的酶液再經(jīng)過Sephadex 75凝膠柱后,出現(xiàn)了許多蛋白峰,但主要獲得的有3個(gè)蛋白峰,分別收集這3個(gè)蛋白峰并進(jìn)行酶活測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰1和峰3均為雜蛋白峰,峰2為目的蛋白峰。將22～29管的酶液收集起來,通過使用10 kDa的超濾濃縮管,對(duì)洗脫下來的酶液進(jìn)行脫鹽濃縮。濃縮后使用SDS-PAGE再次進(jìn)行純度測(cè)定,結(jié)果如圖7。

圖6 皮層裂解酶Superdex 75凝膠過濾洗脫圖Fig.6 Superdex 75 gel filtration eluting diagram of cortex-lytic enzyme

圖7 純化后的皮層裂解酶SDS-PAGE圖Fig.7 SDS-PAGE electrophoresis of the purified cortex-lytic enzymes

由電泳圖7可以看出,在凝膠板上顯示一條蛋白條帶,分子量為61.10 kDa。說明經(jīng)過透析、硫酸銨沉淀、SP-sephadex C-25離子交換層析及Superdex 75凝膠過濾層析純化手段之后,很好地將目的蛋白酶與雜蛋白酶進(jìn)行了分離。最終獲得了達(dá)到電泳純的皮層裂解酶。

在經(jīng)過一系列的分離純化操作后,得到了純度較高的芽孢皮層裂解酶,分別測(cè)定各個(gè)純化操作步驟的總蛋白含量和總酶活力,對(duì)各純化過程的比酶活力、純化倍數(shù)和回收率進(jìn)行計(jì)算,得到相關(guān)參數(shù)來對(duì)純化過程的效果進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?芽孢皮層裂解酶粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀后,比酶活力為158.22 U/mg;經(jīng)SP-sephadex C-25離子交換層析后,比酶活力為218.31 U/mg;經(jīng)Superdex 75凝膠過濾層析純化后,比酶活力可達(dá)1690.75 U/mg,可以看出純化過程中比酶活力逐漸增大。而總酶活力由最初的347.74 U/L降低到67.63 U/L,這是因?yàn)樵诩兓^程中,洗脫液的pH、洗脫溫度以及洗脫液的選擇都會(huì)對(duì)皮層裂解酶活性造成影響,而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),皮層裂解酶活性會(huì)有一些降低,這些因素最終導(dǎo)致了皮層裂解酶總活力在每步洗脫過程中都會(huì)有所降低。最終經(jīng)Superdex 75得到的純化倍數(shù)和回收率分別為14.98倍和19.45%。皮層裂解酶粗酶液經(jīng)過一系列分離純化操作后,其純化倍數(shù)和比酶活力均得到了較大程度的提高,可為后續(xù)的相關(guān)研究提供高純度、活性強(qiáng)的皮層裂解酶。

表2 皮層裂解酶純化過程相關(guān)參數(shù)Table 2 Parameters during the purification of spore cortex-lytic enzymes

2.5 皮層裂解酶結(jié)構(gòu)的傅里葉紅外光譜分析

N-H伸縮振動(dòng)的吸收峰在3400～3440cm-1出現(xiàn),它與氫鍵締合后,向低波數(shù)發(fā)生位移[26]。由圖8可以看出,枯草桿菌皮層裂解酶在3415 cm-1處有一個(gè)強(qiáng)吸收峰,這是由蛋白質(zhì)中N-H伸縮振動(dòng)引起,N-H伸縮振動(dòng)與氫鍵形成了締合體,向低波數(shù)發(fā)生位移?？莶輻U菌芽孢皮層裂解酶在1665、1080、528 cm-1波數(shù)處均有吸收峰,1665 cm-1處的吸收峰是蛋白質(zhì)的特征吸收峰,歸屬于酰胺Ⅰ帶的C=O伸縮振動(dòng)引起,1080 cm-1處的吸收峰是由蛋白質(zhì)中C-O伸縮振動(dòng)引起的。而528 cm-1處的吸收峰是由氨基酸的COO面外搖擺振動(dòng)引起的[27]。

圖8 皮層裂解酶的傅里葉紅外光譜圖Fig.8 FTIR of cortex-lytic enzymes

蛋白質(zhì)在紅外區(qū)有若干特征吸收帶,酰胺Ⅰ帶(1600～1700 cm-1)對(duì)于研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)最有價(jià)值。應(yīng)用二階導(dǎo)數(shù)和曲線擬合的方法對(duì)枯草桿菌芽孢皮層裂解酶酰胺Ⅰ帶(1600～1700 cm-1)曲線擬合,共有10個(gè)子帶譜峰。主要有如下特征峰:1620、1629、1637、1646、1655、1663、1671、1679、1688 cm-1。除了1611 cm-1峰是由氨基酸殘基側(cè)鏈或苯環(huán)振動(dòng)引起的,其余各峰都?xì)w因于蛋白質(zhì)羰基的振動(dòng)吸收[28]。參照Byler等[29]的研究結(jié)果,將子帶譜峰進(jìn)行如下歸屬:1620、1629、1637 cm-1峰指認(rèn)為β-折疊,1655 cm-1峰指認(rèn)為α-螺旋結(jié)構(gòu),1646 cm-1峰指認(rèn)為無規(guī)卷曲,1663、1671、1679、1688 cm-1峰指認(rèn)為β-轉(zhuǎn)角。通過計(jì)算得出,枯草桿菌皮層裂解酶的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲的含量分別為12.80%、31.56%、44.97%、10.68%。

圖9 皮層裂解酶酰胺Ⅰ帶曲線擬合譜圖Fig.9 Fitting curve of amideⅠband of cortex-lytic enzymes

3 結(jié)論

通過硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析的方法,成功分離純化出了枯草桿菌芽孢皮層裂解酶。粗酶液的總酶活為347.74 U/L,回收率為100%;經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀后,總酶活為292.71 U/L,回收率為84.17%,經(jīng)SP-sephadex C-25離子交換層析后的總酶活力為237.96 U/L,回收率為68.43%,最后使用Superdex 75凝膠過濾層析進(jìn)行純化,得到了電泳純的皮層裂解酶并且總酶活力為67.63 U/L,回收率為19.45%。純化后皮層裂解酶的比酶活力由112.90 U/mg增大至1690.75 U/mg,純化出的皮層裂解酶分子量為61.1 kDa。運(yùn)用傅里葉紅外光譜(FTIR)對(duì)芽孢皮層裂解酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,在3415、1665、1080、528 cm-1波數(shù)處有吸收峰,其中在1665 cm-1處有明顯的酰胺I帶,枯草桿菌皮層裂解酶中含12.80%的α-螺旋、31.56%的β-折疊、44.97%的β-轉(zhuǎn)角、以及10.68%的無規(guī)卷曲。本文成功純化了枯草桿菌皮層裂解酶,為研究HPTS對(duì)皮層裂解酶的作用提供實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)而有助于研究HPTS殺滅細(xì)菌芽孢的機(jī)理。