大葉苦丁茶多酚對(duì)四氯化碳致小鼠肝損傷的預(yù)防作用

潘妍霓,趙 欣，龍興瑤,周先容,3,母健菲,3,劉必慧,*

(1.重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心, 功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室,重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系,重慶 400067; 2.車醫(yī)科學(xué)大學(xué)食品生命工學(xué)專業(yè),韓國京畿道 487-010; 3.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715)

肝臟是生物重要的代謝生理器官,肝臟損傷會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的危害?；瘜W(xué)性肝損傷是造成肝功能障礙的常見原因,嚴(yán)重時(shí)甚至可引起肝硬化及肝癌[1]。CCl4是實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)動(dòng)物肝損傷的常用化學(xué)誘導(dǎo)劑,CCl4在引發(fā)肝損傷的過程中會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞大量分泌炎癥因子,從而加劇炎癥作用,加重肝損傷;同時(shí),四氯化碳能引起肝微粒體脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化并破壞細(xì)胞膜,誘發(fā)肝損傷[2]。

苦丁茶是冬青科植物大葉冬青的葉,在華南地區(qū)和西南地區(qū)等地盛產(chǎn),具有抗炎鎮(zhèn)痛、提神解毒、抗高血壓、抗菌等功效[3]?？喽〔枘軌蛞种蒲趸瘧?yīng)激、預(yù)防炎癥等,這與其中的茶多酚有密切關(guān)系[4]。茶葉中的茶多酚是一種天然的抗氧化劑,具有清除自由基和抗氧化等生物活性[5]。特別是針對(duì)CCl4誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肝損傷、脂質(zhì)過氧化以及CCl4與肝微粒體脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致的肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞均可以被茶多酚有效減少[6]。研究表明苦丁茶提取物對(duì)肝損傷有較好的抑制效果[7],但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

Mn-SOD和Cu/Zn-SOD是機(jī)體內(nèi)SOD的異構(gòu)體,是兩種以不同離子為活性中心的SOD自由基清除劑,一定含量的SOD能抑制體內(nèi)的自由基,起到預(yù)防肝損傷的作用[8]。IκB-α是抑炎因子,四氯化碳導(dǎo)致肝臟受損引起的氧化磷酸化會(huì)降解IκB-α,從而誘發(fā)炎癥反應(yīng),低IκB-α水平標(biāo)志著肝臟損傷[9]。COX-2通常在機(jī)體組織非正常狀態(tài)下表達(dá),是一種重要的炎癥標(biāo)志物[10]。NO是一種高活性氧化劑,通過肝細(xì)胞中活化的 NOS在肝臟中產(chǎn)生,在肝損傷一定時(shí)期后,能夠促進(jìn)iNOS基因的高表達(dá),同時(shí),炎癥因子iNOS 誘導(dǎo)產(chǎn)生的 NO 也進(jìn)一步促進(jìn)肝臟發(fā)生損傷[11]。CAT是生物體中一種抗氧化酶,通過清除機(jī)體中的H2O2,抑制氧化應(yīng)激,減輕CCl4給生物體帶來的氧化,預(yù)防肝損傷[12]。TNF-α是最關(guān)鍵的促炎介質(zhì),對(duì) NF-κB的活化起正反饋調(diào)節(jié)作用,它既是 NF-κB的激活物,也是其激活后的產(chǎn)物,低濃度的TNF-α可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞生長分化與再生,但高濃度的TNF-α既可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡,是造成肝細(xì)胞損傷的主要因子[13]。NF-κB是一種機(jī)體內(nèi)至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子,它可以調(diào)節(jié)肝損傷等炎癥反應(yīng)所需的基因表達(dá)水平,高NF-κB水平可表示肝損傷[14]。IL-1β是由肝臟中的Kupffer細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子,IL-1β可吸引中性粒細(xì)胞,引起炎癥介質(zhì)釋放,從而加劇肝損傷[15]。

本研究使用CCl4對(duì)肝臟進(jìn)行處理,建立小鼠化學(xué)性肝損傷模型,以大葉苦丁茶多酚提取物為研究對(duì)象,觀察大葉苦丁茶多酚提取物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝損傷的預(yù)防作用,進(jìn)一步采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)小鼠血清和肝組織相關(guān)指標(biāo),從機(jī)理上闡釋大葉苦丁茶多酚提取物對(duì)小鼠肝損傷的改善作用。研究成果將益于大葉苦丁茶多酚提取物的開發(fā)利用,為大葉苦丁茶多酚在食品加工和保健品研發(fā)中的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大葉苦丁茶 蕪湖市徽茶品茶葉有限公司;清潔級(jí)雄性昆明小鼠50只(動(dòng)物許可證SCXK(渝)2012-0001) 重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,在濕度50%±20%、溫度(22±4) ℃下飼養(yǎng)1周后正式進(jìn)行實(shí)驗(yàn);AST試劑盒、ALT試劑盒 南京建成生物工程研究所;甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒、總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;水飛薊素 美國Sigma公司;Trizol、First Strand cDNA Synthesis試劑盒 賽默飛世爾;沒食子酸、福林酚、甲醇、ABTS 南京都萊生物技術(shù)有限公司;DPPH阜陽曼琳生物技術(shù)有限公司;無水乙醇 重慶川東化工有限公司;三氯化鋁 天津市大茂化學(xué)試劑廠;氯化鋅 天津市北辰方正試劑廠;三氯化鐵、FeSO4、水楊酸 成都市科龍化工試劑廠。

KQ-100超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;電子天平 上海舜宇恒平科技儀器有限公司;Step One Plus定量PCR儀、Biomate3S紫外可見分光光度儀、LUX多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾;R1002VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;ICEN-24R高速冷凍離心機(jī) 杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大葉苦丁茶多酚的提取 將大葉苦丁茶打碎成粉,稱取100 g加入100 mL 45%乙醇溶液,90 ℃下浸提30 min,重復(fù)浸提2次,合并2次浸提液,調(diào)節(jié)浸提液pH至6.0,加入AlCl3(6 g)和ZnCl2(12 g)混合沉淀劑進(jìn)行沉淀,將混合液在3000 r/min離心10 min,將200 mL 12%鹽酸(V/V)加入收集到的沉淀中轉(zhuǎn)溶,抽濾分離出上清液,分別2次加入200 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取。最后對(duì)萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到多酚提取物[16]。

1.2.2 大葉苦丁茶多酚提取物的含量測(cè)定 稱量一定量的標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸,加入60%乙醇,制備沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,精密量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.4、0.6、0.8、1.0及1.2 mL),分別置于6個(gè)50 mL量瓶中,各加20 mL蒸餾水,分別加入 5 mL 0.2 mol·L-1Folin-Ciocalteu試劑,然后加入6 mL 100 g·L-1碳酸鈉溶液,加水至50 mL,振搖,避光反應(yīng)2 h 后,用蒸餾水做空白,760 nm處測(cè)定OD值。以沒食子酸質(zhì)量濃度和OD值分別為橫、縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將大葉苦丁茶按照以上方法平行測(cè)定3次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.0665X+0.0328,R2=0.9996,Y為吸光度值,X是沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度)計(jì)算大葉苦丁茶多酚的含量[17]。

1.2.3 大葉苦丁茶多酚提取物的抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 大葉苦丁茶多酚提取物DPPH清除自由基能力 稱取DPPH 12.5 mg置于100 mL容量瓶中,加無水乙醇溶解,定容至刻度,用時(shí)再稀釋至25 g/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。參照王曉宇等[18]的方法,利用配制好的DPPH試劑測(cè)定大葉苦丁茶粗多酚的抗氧化效果。將0.1 g PLK定容于10 mL的容量瓶中配制成10 mg/mL的PLK溶液,再稀釋10倍制成1 mg/mL的PLK溶液。將1 mg/mL的PLK溶液分別稀釋成20、40、60和80 μg/mL的PLK溶液,分別取100 μL 配制的各濃度PLK溶液和3.9 mL以無水乙醇為溶劑的DPPH自由基溶液混合后所測(cè)得的吸光度設(shè)為A1,100 μL的配制的各濃度PLK溶液和3.9 mL無水乙醇混合所得吸光度記為A2,100 μL 80%甲醇溶液與3.9 mL DPPH溶液混合所得吸光度記為A3,室溫下避光放置30 min后,吸取200 μL最終反應(yīng)液于96孔板中,用酶標(biāo)儀在波長517 nm處測(cè)定吸光值。以VC(濃度為20、40、60和80 μg/mL)為陽性對(duì)照,每個(gè)樣品重復(fù)3次,取平均值。按以下公式計(jì)算:

DPPH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

1.2.3.2 大葉苦丁茶多酚提取物對(duì)清除ABTS活性的測(cè)定 配制7 mmol/L ABTS溶液、140 mmol/過硫酸鉀溶液、ABTS反應(yīng)液。參照蔡文國等[19]的方法,5 mL ABTS反應(yīng)溶液+200 μL PLK溶液(濃度為20、40、60和80 μg/mL)記為A1,5 mL無水乙醇+200 μL樣液(濃度為20、40、60和80 μg/mL的PLK溶液)記為A2,5 mLABTS溶液+200 μL 80%甲醇溶液記為A0,混勻后室溫下避光反應(yīng)6 min,吸取200 μL最終反應(yīng)液于96孔板中用酶標(biāo)儀在波長734 nm處測(cè)定吸光值。以VC為陽性對(duì)照,每個(gè)樣品重復(fù)3次,取平均值。按以下公式計(jì)算:

ABTS清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.3.3 大葉苦丁茶多酚提取物對(duì)清除羥自由基的測(cè)定 配制9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol水楊酸乙醇溶液、8.8 mmol H2O2溶液,參照賈榮等[20]的方法,300 μL 80%甲醇+2.0 mL FeSO4+1.0 mL水楊酸乙醇溶液+1.0 mL H2O2混合溶液記為A0,300 μL樣液(濃度為20、40、60和80 μg/mL)+2.0 mL FeSO4+1.0 mL水楊酸乙醇溶液+1.0 mL H2O2混合溶液記為A1,300 μL樣液(濃度為20、40、60和80 μg/mL)+2.0 mL FeSO4+1.0 mL水楊酸乙醇溶液+1.0 mL 80%甲醇混合溶液記為A2,放置于37 ℃水浴鍋中加熱30 min后,吸取200 μL最終反應(yīng)液于96孔板中在波長510 nm處測(cè)定吸光值。按以下公式計(jì)算:

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.3.4 大葉苦丁茶多酚提取物對(duì)還原力的測(cè)定 配制1%鐵氰化鉀、10%三氯乙酸、0.1%三氯化鐵,采用鐵離子還原力測(cè)定法[21]。分別取200 μL不同濃度(20、40、60和80 μg/mL)的PLK溶液,加入0.2 mol/L搖勻后的PBS緩沖液2.5 mL,1% K3Fe(CN)6溶液2.5 mL,充分混勻后在50 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 min,使其快速冷卻,再加入體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸2.0 mL終止反應(yīng)。取混合液2.5 mL,加入蒸餾水2.5 mL和0.1% FeCl30.5 mL,充分混勻,在室溫下靜置10 min,于700 nm處測(cè)吸光值。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 小鼠分組實(shí)驗(yàn) 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、水飛薊素組(100 mg/kg)、低劑量大葉苦丁茶(LPLK)組(50 mg/kg)、高劑量大葉苦丁茶(HPLK)組(100 mg/kg)5組。用適應(yīng)飼養(yǎng)1周后的小鼠開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn),正常組和模型組小鼠每只每天灌胃0.2 mL生理鹽水;PLK高低劑量組的小鼠分別用相應(yīng)濃度的PLK每只每天進(jìn)行灌胃0.2 mL;水飛薊素組的小鼠每只每天按100 mg/kg劑量灌胃水飛薊素溶液0.2 mL,實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行14 d,所有小鼠均自由飲水,使用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。第14 d對(duì)除正常組外所有小鼠腹腔注射四氯化碳化學(xué)誘導(dǎo)劑(CCl4∶花生油=1∶125,V/V),每只小鼠注射0.2 mL CCl4化學(xué)誘導(dǎo)溶液后對(duì)所有小鼠實(shí)施禁食,但允許自由飲水。禁食24 h后將5組小鼠進(jìn)行眼球取血,斷頸處死,解剖取肝臟待用[5]。

1.2.4.2 小鼠肝指數(shù) 稱量小鼠肝臟重量,肝臟指數(shù)按公式進(jìn)行計(jì)算:

肝指數(shù)(%)=(小鼠肝重量/小鼠體重)×100

1.2.4.3 小鼠血清指標(biāo)的測(cè)定 血漿在4 ℃ 4000 r/min離心10 min分離上層獲得血清,并于-80 ℃保存待用。使用AST、ALT、TG、TC試劑盒分別測(cè)定小鼠血清相關(guān)水平。

1.2.4.4 小鼠肝組織病理學(xué)觀察 將肝右葉的1/2固定在10%福爾馬林中,用95%(v/v)乙醇脫水,再用二甲苯將肝組織中的乙醇替換出來,石蠟包埋,冷卻并切片,將嵌入的肝臟用HE染色發(fā)染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察[22]。

1.2.5 qPCR測(cè)定小鼠肝組織COX-2、iNOS、NF-κB、IκB-α、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、IL-1β、CAT、TNF-α的mRNA表達(dá) 將100 mg肝組織、1 mL Trizol和200 μL三氯甲烷用均質(zhì)機(jī)均質(zhì);以14000 r/min在4 ℃條件下離心均質(zhì)15 min,得到上清液;按上清液∶異丙醇=1∶1 (V/V)加入異丙醇,在4 ℃下放置15 min后,以4 ℃ 14000 r/min的條件離心20 min得到RNA。通過測(cè)定RNA在260和280 nm處的吸光度值,計(jì)算出RNA的濃度,再將RNA用去酶水稀釋為濃度1 μg/μL 的液體;用9 μL的oligo Primer DT 與1 μL稀釋后的RNA混合后放入PCR儀,以65 ℃ 5 min完成一個(gè)熱循環(huán);再加入4 μL 5×Reaction Buffer,1 μL Ribolock RNase inhibitor,2 μL 100 mmol/L dNTP mix和1 μL RevertAid RT,混勻后以42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min的條件放于PCR儀生成cDNA。將1 μL cDNA,10 μL Master Mix,上下游引物各1 μL(表1)和7 μL ddH2O混勻后放入qPCR儀器,使用程序94 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),58 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,最終75 ℃ 10 min測(cè)定其Ct值[23]。引物序列見表1。

表1 本研究中的引物序列Table 1 Sequences of reverse transcription polymerase chain reaction primers used in this study

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,用平行實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行平均化,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用one-way ANOVA法分析在p=0.05水平上各組數(shù)據(jù)是否存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉苦丁茶多酚含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)測(cè)得大葉苦丁茶多酚的含量為4.99 mg/mL。有研究表明苦丁茶多酚含有多種具有生物活性作用的物質(zhì),包括綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C[24]。研究表明苦丁茶豐富的多酚成分具有較好的抗氧化效果,體外研究顯示苦丁茶的多酚含量較高,作為有效成分顯示出較好的抗氧化效果[25-26]。

2.2 大葉苦丁茶多酚提取物體外抗氧化

對(duì)大葉苦丁茶多酚提取物DPPH清除自由基、ABTS、羥自由基能力及對(duì)Fe3+還原能力進(jìn)行的測(cè)定結(jié)果,如圖1所示。

圖1 大葉苦丁茶多酚提取物的體外抗氧化活性 Fig.1 The results of antioxidant activities and free radical scavenging abilities of PLK in vitro注:A:DPPH法測(cè)定對(duì)大葉苦丁茶多酚提取物的氧化效果;B:大葉苦丁茶多酚提取物對(duì)清除ABTS活性的測(cè)定; C:大葉苦丁茶多酚提取物對(duì)清除羥自由基的測(cè)定;D:大葉苦丁茶多酚提取物對(duì)Fe3+還原力的測(cè)定。

DPPH·是一種很穩(wěn)定的自由基,通常被用來檢測(cè)抗氧化劑的抗氧化活性。圖1(A)結(jié)果顯示大葉苦丁茶多酚提取物清除自由基DPPH·的能力隨著濃度的增大而增強(qiáng);濃度為40 μg/mL時(shí),PLK提取物清除自由基DPPH·的能力明顯低于VC對(duì)照組,抗氧化物質(zhì)清除DPPH·自由基的能力和其抗氧化活性成正比[27]。

在合適的氧化劑作用下,ABTS被氧化成ABTS+·,并且抗氧化物會(huì)抑制ABTS+·的產(chǎn)生[28]。由圖1(B)可知,大葉茶多酚的ABTS活性清除率最大值為19.16%,此時(shí)PLK濃度為80 μg/mL,PLK提取物的ABTS清除率隨濃度增大的變化幅度減小,且效果優(yōu)于VC對(duì)照組。

羥自由基主要引起機(jī)體脂質(zhì)過氧化破壞細(xì)胞,還與有機(jī)體中的糖類、氨基酸、核酸、有機(jī)酸等物質(zhì)反應(yīng),造成細(xì)胞損傷,甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞死亡或突變[29]。從圖1(C)顯示結(jié)果可得,大葉苦丁茶多酚提取物的羥自由基清除率隨濃度增大呈上升趨勢(shì),且增強(qiáng)幅度與VC對(duì)照組相似,但效果不如同等濃度的VC對(duì)照組。

化學(xué)物質(zhì)清除自由基的能力與還原能力強(qiáng)弱成正比,故以抗氧化劑對(duì)三價(jià)鐵還原能力的強(qiáng)弱來反應(yīng)其抗氧化活性的高低。圖1(D)結(jié)果顯示,隨PLK和VC濃度的增大,PLK提取物的還原力與VC對(duì)照組的還原力,呈逐步上升的形態(tài),但與VC對(duì)照組相比,PLK提取物還原力增長幅度較小。

以上數(shù)據(jù)分析可以得出,不同濃度的PLK和VC都具有較明顯的清除自由基作用,且清除率隨藥物濃度的增加而逐漸增大,結(jié)果表明,PLK具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2.3 大葉苦丁茶多酚對(duì)CCl4致小鼠肝損傷效果

2.3.1 小鼠肝指數(shù)測(cè)定 肝臟重量和肝臟指數(shù)是評(píng)估肝臟損傷的重要指標(biāo),高肝指數(shù)是肝損傷的重要表現(xiàn)之一[30]。由表2結(jié)果顯示,模型組的肝重和肝指數(shù)在5組小鼠中為最高,模型組與正常組相比,肝臟重量、肝臟臟器指數(shù)均出現(xiàn)明顯升高(p<0.05),說明本研究造模成功。正常組的肝重和肝指數(shù)為5組中最低,水飛薊素組和PLK組的肝重和肝指數(shù)與模型組比均有不同程度的減低,且PLK組與模型組存在顯著性差異(p<0.05),高劑量PLK組的肝重和肝臟指數(shù)比低劑量PLK組的肝重和肝臟指數(shù)更接近水飛薊素組,且HPLK組的肝重與肝指數(shù)與水飛薊素組無明顯差異,此結(jié)果說明PLK能有效的降低CCl4給肝臟帶來的損傷。本研究結(jié)果表明,與肝損傷對(duì)照組小鼠相比,PLT能夠使肝損傷小鼠的肝指數(shù)下降,且效果接近于藥物水飛薊素。

表2 PLK對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠的體重、肝重和肝指數(shù)的影響(n=10)Table 2 Effects of PLK on body weight,liver weight and liver index in mice with CCl4-induced hepatic damage(n=10)

2.3.2 實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織病理學(xué)觀察 組織病理學(xué)切片是檢測(cè)肝損傷的一種重要技術(shù),通過對(duì)小鼠肝組織切片的觀察分析,可進(jìn)行肝損傷評(píng)價(jià)[31]。如圖2所示,從小鼠的肝臟H&E染色切片能觀察到,正常組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、完整且排列整齊有序;模型組小鼠肝組織呈現(xiàn)出大面積壞死細(xì)胞,炎癥細(xì)胞浸潤,細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞且排列不均勻;與模型組小鼠相比,PLK組和水飛薊素組均能在一定程度上減小CCl4引起的肝細(xì)胞壞死,且高濃度PLK效果更為明顯,說明高劑量PLK對(duì)肝損傷的保護(hù)效果較好,與藥物水飛薊素效果相近。

圖2 實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織病理學(xué)H&E切片觀察(200×)Fig.2 Pathological observation of hepatic tissues in experimental mice(200×)

2.3.3 實(shí)驗(yàn)小鼠血清指標(biāo)的測(cè)定 ALT和AST是兩種檢測(cè)肝損傷的標(biāo)示性轉(zhuǎn)氨酶。肝細(xì)胞受損后,會(huì)導(dǎo)致AST和ALT等酶類物質(zhì)釋放到血液中,不同的肝損傷程度,小鼠血清將檢測(cè)出不同的AST和ALT水平,因此,檢測(cè)血清中ALT、AST的活性能準(zhǔn)確反映肝損傷的程度[27]。如表3所示,在四氯化碳致小鼠肝損傷后,模型組小鼠血清中AST、ALT、TG、和TC水平較正常組小鼠血清中各指標(biāo)的含量均有顯著的上升(p<0.05)。PLK組小鼠血清中的AST、ALT、TG、和TC水平與模型組相比顯著降低(p<0.05),但高于水飛薊素組,且高劑量PLK組較低劑量PLK組個(gè)指標(biāo)下調(diào)更為明顯。

表3 PLK對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清中AST、ALT、TG、和TC的水平含量影響Table 3 Effects of PLK on serum levels of AST,ALT,TG and TC in mice with CCl4-induced hepatic damage

CCl4引發(fā)的肝損傷可導(dǎo)致脂肪酸轉(zhuǎn)移至肝組織內(nèi),導(dǎo)致肝臟中TG含量增加,TC也是肝損傷引起的脂質(zhì)過氧化的指標(biāo),肝損傷后的脂質(zhì)過氧化引起TG和TC水平上升[32]。由此可見,PLK可以有效調(diào)控小鼠AST、ALT、TG和TC水平,減小機(jī)體受四氯化碳的影響。

2.4 大葉苦丁茶多酚對(duì)CCl4損傷的小鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.4.1 實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和IκB-α表達(dá) 四氯化碳導(dǎo)致肝氧化代謝中產(chǎn)生三氯甲基自由基,自由基攻擊脂質(zhì)細(xì)胞膜,導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化性的損傷,通過抑制肝組織的氧化和減少肝組織中的自由基,可以有效的控制組織損傷[33]。從圖3可以看出,Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和IκB-α在正常組肝組織中的表達(dá)水平顯著高于其他各實(shí)驗(yàn)處理組(p<0.05)。模型組的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和IκB-α表達(dá)量與其他四組相比較顯著降低,PLK可顯著緩解表達(dá)降低(p<0.05),且高濃度PLK效果優(yōu)于低劑量組,其表達(dá)水平與水飛薊素治療組的表達(dá)水平相當(dāng)。結(jié)果表明PLK能夠有效調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和IκB-α表達(dá),從而發(fā)揮其對(duì)肝損傷的抑制作用?？喽〔柚胸S富的多酚物質(zhì)具有抗氧化效果,將有可能通過其抗氧化作用抑制四氯化碳對(duì)肝組織造成的損傷。

圖3 小鼠肝組織中Cu/Zn-SOD(A)、Mn-SOD(B)和IκB-α(C)的mRNA表達(dá)的定量分析Fig.3 Quantitative analysis of mRNA expression of Cu/Zn-SOD(A),Mn-SOD(B)and IκB-α(C)in liver of mice注:不同小寫字母代表差異性顯著,p<0.05,圖4～圖5同。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織COX-2、iNOS和CAT表達(dá) 如圖4所示,模型組小鼠肝組織中COX-2和iNOS表達(dá)與正常組小鼠相比有明顯的升高而CAT水平較正常組小鼠有顯著的下降(p<0.05)。PLK組小鼠肝組織中的COX-2和iNOS水平表達(dá)與模型組相比有明顯的降低(p<0.05);CAT水平與模型組相比有明顯的上升(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PLK對(duì)肝組織的COX-2、iNOS和CAT表達(dá)有明顯的調(diào)控作用,能夠通過調(diào)控這些表達(dá)起到抑制肝損傷的作用。

圖4 小鼠肝組織中COX-2(A)、iNOS(B)和CAT(C)的mRNA表達(dá)的定量分析Fig.4 Quantitative analysis of mRNA expression of COX-2(A),iNOS(B)and CAT(C)in liver of mice

2.4.3 實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織TNF-α、NF-κB和IL-1β表達(dá) 如圖5,CCl4使TNF-α、NF-κB和IL-1β在模型組小鼠肝組織中具有最高表達(dá)量(p<0.05)。與模型組相比,水飛薊素和PLK均能降低CCl4引起的TNF-α、NF-κB和IL-1β表達(dá),高劑量PLK組TNF-α、NF-κB和IL-1β表達(dá)顯著低于低劑量PLK組(p<0.05),但略高于水飛薊素組。因此,PLK可降低肝損傷小鼠的TNF-α、NF-κB和IL-1β表達(dá)(p<0.05),且作用類似于水飛薊素。PLK對(duì)肝組織的炎性表達(dá)TNF-α、NF-κB和IL-1β均有明顯的作用,從而可以看出PLK能夠調(diào)控四氯化碳引發(fā)的炎癥反應(yīng),從而減輕炎癥,抑制肝損傷。

圖5 各組小鼠肝組織中TNF-α(A)、NF-κB(B)和IL-1β(C)的mRNA表達(dá)的定量分析Fig.5 Quantitative analysis of TNF-α(A),NF-Κb(B)and IL-1β(C)mRNA expressions in liver of mice indifferent group

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明大葉苦丁茶多酚提取物對(duì)四氯化碳導(dǎo)致的小鼠肝損傷具有較好的改良作用。PLK能下調(diào)肝損傷小鼠的肝指數(shù);肝損傷小鼠血清中的 AST、ALT、TG、TC水平能被PLK有效降低;qPCR結(jié)果表明,PLK 可使肝損傷小鼠肝組織中Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、IκB-α、CAT的 mRNA表達(dá)顯著上調(diào),并下調(diào)COX-2、iNOS、TNF-α、NF-κB、IL-1β的 mRNA表達(dá)。因此,PLK對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有較好的改善和預(yù)防作用,且與藥物水飛薊素有相近效果,具有良好的開發(fā)利用潛質(zhì)。