AMPKα2基因shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建以及在氯離子介導(dǎo)的大鼠心肌缺氧/復(fù)氧損傷中的作用*

劉 丹， 孫 惦， 許 旻， 周 敏， 吳曉牧， 何 明△

(1南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西南昌330006)

一直以來(lái)，人們對(duì)心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷機(jī)制的研究都聚焦于Ca2+，而Cl－作為機(jī)體內(nèi)最富生理意義的陰離子，其在心肌缺血/再灌注損傷中的作用卻一直未得到重視。本實(shí)驗(yàn)室一直致力于研究Cl－在心肌缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation，A/R)損傷中所起的作用，已發(fā)現(xiàn)去除細(xì)胞外Cl－能通過(guò)減少氧化應(yīng)激而很好地對(duì)抗心肌A/R損傷，但具體機(jī)制不明。AMP活化的蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)是高度保守的蛋白激酶家族，由于其在調(diào)節(jié)能量代謝、參與氧化應(yīng)激等方面的突出作用而日趨引起人們的關(guān)注［1］。AMPK是一個(gè)由催化亞基α(63 kD)、調(diào)節(jié)亞基β(30 kD)和 γ(38～63 kD)所構(gòu)成的異源三聚體［2］。α 亞基含有一個(gè)重要的Thr172殘基，是主要的活性基團(tuán)，磷酸化使AMPK激活［3］。那么AMPK是否與這種由活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)的氯離子動(dòng)態(tài)變化所致心肌急性A/R損傷有關(guān)呢?目前還未有文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)擬用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建pSuper－AMPKα2 shRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，并建立A/R損傷模型以模擬I/R損傷，以期探討AMPK在Cl－介導(dǎo)的心肌A/R損傷中所起的作用，為研究心肌I/R損傷機(jī)制拓展思想、提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞與主要試劑

大鼠H9c2心肌樣細(xì)胞:中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);pSuper.Retro質(zhì)粒:美國(guó)波士頓大學(xué)羅志軍教授惠贈(zèng);限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ:NEB;T4 DNA連接酶、凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega;AMPKα2抗體、β－actin抗體及相應(yīng)II抗購(gòu)自Santa Cruz;LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen;MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco－BRL;ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beyotime Institute of Biotechnology;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光印跡試劑、硝酸纖維素膜(Amersham)、胰酶、MTT、HEPES、PMSF、亮肽素、丙烯酰胺、SDS、亞甲基雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、TEMED、EDTA和DTT購(gòu)自Sigma;其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 在 GenBank中搜索出大鼠AMPKα2 mRNA全長(zhǎng)序列(NM_023991)，登陸Ambion公司網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)3條siRNA靶序列，分別為:(1)5’－GCGAGCAACUAUCAAAGAC－3’(764);(2)5’－CCCAAAGCACGCUGUCCAC－3’(1131);(3)5’－ACUCUACCAAGUGAUCAGC －3’(233)。以質(zhì)粒 pSuper.Retro為載體，限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ、XhoⅠ雙切后，插入帶有黏性末端的 AMPKα2 shRNA核苷酸序列。按小提質(zhì)粒試劑盒說(shuō)明操作提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化菌液送北京天根生化科技有限公司測(cè)序鑒定。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前，PBS洗滌細(xì)胞2次，盡量去除抗生素和血清，將 LipofectamineTM2000(μL)與 DNA(μL)以 2.0∶0.8 的比例混合，加入到每孔細(xì)胞中去，置于培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣，37℃)中孵育5 h后，換含血清的培養(yǎng)基。以空載質(zhì)粒載體pSuper為對(duì)照。

2.3 重組質(zhì)粒干擾效率的檢測(cè) 為了更好地提高干擾效率，將3個(gè)含AMPKα2基因序列特異性shRNA 的重組質(zhì)粒(pSuper－AMPKα2 shRNA1，pSuper－AMPKα2 shRNA2，pSuper－ AMPKα2 shRNA3)同時(shí)轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞 H9c2中，Western blotting檢測(cè)AMPKα2的蛋白表達(dá)水平。

2.4 缺氧液、復(fù)氧液及去除細(xì)胞外Cl－(Cl－－free)液的配制 缺氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，6.0 mmol·L－1NaHCO3，1.2 mmol·L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1CaCl2，98.5 mmol·L－1NaCl，10.0 mmol·L－1KCl，40 mmol·L－1乳酸鈉，20 mmol·L－1HEPES，pH 6.8;復(fù)氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，20.0 mmol·L－1NaHCO3，1.2 mmol·L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1CaCl2，129.5 mmol·L－1NaCl，5.0 mmol·L－1KCl，55 mmol·L－1葡萄糖，20 mmol·L－1HEPES，pH 7.4;Cl－－free缺氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，6.0 mmol·L－1NaHCO3，1.2 mmol·L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1葡萄糖酸鈣，98.5 mmol·L－1葡萄糖酸鈉，10.0 mmol·L－1葡萄糖酸鉀，40 mmol·L－1乳酸鈉，20 mmol·L－1HEPES，pH 6.8;Cl－－free 復(fù)氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，20.0 mmol· L－1NaHCO3，1.2 mmol· L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1葡萄糖酸鈣，129.5 mmol·L－1葡萄糖酸鈉，5.0 mmol·L－1葡萄糖酸鉀，55 mmol·L－1葡萄糖，20 mmol·L－1HEPES，pH 7.4。

2.5 實(shí)驗(yàn)分組 (1)正常對(duì)照(control)組:去除原培養(yǎng)基，換用復(fù)氧液置于培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣，37℃)3 h，再換上復(fù)氧液孵育2 h;(2)A/R組:去除原培養(yǎng)液，換用模擬缺氧缺糖溶液將培養(yǎng)板置于持續(xù)95%N2、5%CO2平衡的缺氧密閉容器中(37℃)3 h，再換上模擬再灌注液，95%O2、5%CO2進(jìn)行復(fù)氧孵育2 h(37℃);(3)去除細(xì)胞外Cl－的A/R(Cl－－free A/R)組:將缺氧、復(fù)氧液換成 Cl－－free缺氧液和Cl－－free復(fù)氧液，其余操作與A/R組一致;(4)pSuper+Cl－－free A/R組:空載質(zhì)粒p pSuper轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中，24 h后處理同A/R組;(5)pSuper－AMPKα2 shRNA+Cl－－free A/R 組:重組質(zhì)粒pSuper－AMPKα2 shRNA轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中，24 h后處理同A/R組。

2.6 Western blotting檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，三去污劑裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，同等量蛋白質(zhì)完成SDS－PAGE后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，再結(jié)合I抗、II抗，最后X線膠片曝光分析。

2.7 細(xì)胞存活率 采用MTT比色法檢測(cè)。胰酶消化后收集細(xì)胞，每組細(xì)胞以1×104cells/well濃度接種于96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%～80%后吸出培養(yǎng)基。每孔加入 MTT溶液(5 g·L－1溶于PBS)20 μL，37 ℃孵育 4 h。吸棄上清液，每孔加DMSO 150 μL振蕩10 min，使藍(lán)色結(jié)晶充分溶解。490 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度值即A值，以間接反映各組活細(xì)胞數(shù)量。

2.8 生化檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組分別取孵育液200 μL，Beckman生化自動(dòng)分析儀測(cè)定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性。

2.9 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入10 μL Annexin V －FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，再加入300 μL binding buffer，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.10 細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2～3次，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化細(xì)胞后收集，將配制好的10 μmol/L DCFH－DA溶液500 μL重懸細(xì)胞，37℃孵育30 min，800×g離心5 min，棄上清，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2～3次，制成1×108cells/L的懸液，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以488 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，以530 nm為發(fā)射波長(zhǎng)。以不加DCFH－DA的1管為陰性對(duì)照。

2.11 細(xì)胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH－Px)活性測(cè)定 處理結(jié)束后，消化收集心肌細(xì)胞，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心后取上清液，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件行組間方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定

轉(zhuǎn)化菌液經(jīng)北京天根生化科技有限公司測(cè)序，結(jié)果表明shRNA序列成功構(gòu)建于pSuper.Retro質(zhì)粒表達(dá)載體上，結(jié)果完全符合設(shè)計(jì)要求，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Sequencing of recombinant plasmids pSuper－ AMPKα2 shRNA1，pSuper－ AMPKα2 shRNA2 and pSuper－ AMPKα2 shRNA3(partial).圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序鑒定結(jié)果

2 重組質(zhì)粒干擾效果的檢測(cè)

Control組AMPKα2蛋白在H9c2細(xì)胞中呈基礎(chǔ)性表達(dá);轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pSuper后AMPKα2蛋白表達(dá)與control組比較無(wú)明顯差異;而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSuper－AMPKα2 shRNA 之后 AMPKα2蛋白表達(dá)則顯著降低(P＜0.01)，見(jiàn)圖2，提示重組RNA干擾質(zhì)粒能有效降低AMPKα2蛋白表達(dá)。

Figure 2.Silencing efficiency of pSuper－ AMPKα2 shRNA detected by Western blotting.ˉx±s.n=6.##P＜0.01 vs control group.圖2 Western blotting檢測(cè)pSuper－AMPKα2 shRNA的沉默效率

3 各處理組對(duì)心肌細(xì)胞存活率和LDH活性的影響

A/R組與control組比較，細(xì)胞存活率明顯下降，LDH活性明顯升高(P＜0.01);Cl－－free A/R組與A/R組相比，細(xì)胞存活率明顯升高，LDH活性明顯下降(P＜0.01)，提示Cl－－free液對(duì)心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用;轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSuper－AMPKα2 shRNA則明顯阻斷了Cl－－free液的這種保護(hù)作用，細(xì)胞存活率下降，LDH活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表 1。

4 各處理組對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

A/R組較之control組，細(xì)胞凋亡明顯增加(P＜0.01);Cl－－freeA/R組與A/R組比較，細(xì)胞凋亡明顯減輕(P＜0.01)，提示去除細(xì)胞外Cl－能對(duì)抗心肌A/R損傷;轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的pSuper－AMPKα2 shRNA+Cl－－free A/R組與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組相比，細(xì)胞凋亡進(jìn)一步明顯升高(P＜0.01)，提示pSuper－AMPKα2 shRNA重組質(zhì)粒能阻斷Cl－－free液對(duì)抗心肌細(xì)胞A/R損傷的作用，見(jiàn)圖3。

表1 AMPKα2低表達(dá)對(duì)各處理組心肌細(xì)胞存活率和LDH活性的影響Table 1.Effect of down－regulation of AMPKα2 on viability and LDH activity of cardiomyocytes in each group(ˉx±s.n=6)

5 各處理組對(duì)心肌細(xì)胞ROS生成的影響

H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)A/R處理后，與control組比較ROS含量明顯升高(P＜0.01);Cl－－free A/R與A/R組相比，ROS含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示Cl－－free能減少A/R損傷所致的ROS爆發(fā);pSuper－AMPKα2 shRNA+Cl－－free A/R組與未轉(zhuǎn)染組相比，則能明顯增加ROS的生成(P＜0.01)，提示 pSuper－AMPKα2 shRNA 重組質(zhì)粒能阻斷Cl－－free抑制A/R損傷致ROS生成增加的作用，見(jiàn)圖4。

6 各處理組對(duì)心肌細(xì)胞抗氧化物酶SOD及GSHPx活性的影響

A/R組與control組比較，細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶SOD及GSH－Px活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);Cl－－free A/R組與A/R組相比，細(xì)胞內(nèi)SOD及GSH－Px活性顯著升高(P＜0.01)，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSuper－AMPKα2 shRNA后，SOD及GSH－Px活性再次下降，提示重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染阻斷了Cl－－free對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的保護(hù)作用，見(jiàn)表2。

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，Cl－在心肌低滲、缺血缺氧、應(yīng)急刺激等異常條件下，可引起心律失常并對(duì)心功能產(chǎn)生較大影響［4］。Lai等［5］利用離子敏感型玻璃微電極記錄技術(shù)，成功觀察到心肌缺血時(shí)細(xì)胞內(nèi)Cl－濃度急劇增加，進(jìn)而引發(fā)心律失常。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，去除細(xì)胞外Cl－行A/R損傷，心肌細(xì)胞損傷較未去除細(xì)胞外Cl－組比較明顯減輕，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率升高，凋亡減少，并且Cl－－free對(duì)抗A/R損傷的這種保護(hù)作用伴隨著ROS生成減少。

Figure 3.Effect of down－regulation of AMPKα2 on apoptosis of cardiomyocytes in each group.ˉx±s.n=6.##P＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs A/R group;△△P ＜0.01 vs Cl－ －free A/R group.圖3 AMPKα2低表達(dá)對(duì)各處理組心肌細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4.Effect of down－regulation of AMPKα2 on ROS production of cardiomyocytes in each group.ˉx±s.n=6.##P＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs A/R group;△△P ＜0.01 vs Cl－ －free A/R group.圖4 AMPKα2低表達(dá)對(duì)各處理組心肌細(xì)胞ROS生成的影響

表2 AMPKα2低表達(dá)對(duì)各處理組心肌細(xì)胞SOD和GSHPx活性的影響Table 2.Effect of down－regulation of AMPKα2 on SOD and GSH－Px activity in cardiomyocytes in each group(ˉx±s.n=6)

ROS被認(rèn)為在維持心血管穩(wěn)態(tài)方面有著十分重要的生理和病理生理作用，ROS的大量產(chǎn)生是導(dǎo)致心肌I/R急性損傷的主要因素之一［6］。由于ROS主要是在線粒體中產(chǎn)生，與能量代謝密切相關(guān)［7］，且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［8］，在β細(xì)胞中AMPK的持續(xù)激活可引起ROS的產(chǎn)生增加;有鑒于此，我們高度懷疑 Cl－－free對(duì)抗心肌A/R損傷的機(jī)制與AMPK有關(guān)。

RNAi是近年來(lái)新興的研究生物體基因表達(dá)、調(diào)控與功能的技術(shù)手段，其分子機(jī)制是真核生物細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄后引發(fā)的基因沉默，RNAi作為一種反向遺傳學(xué)手段已經(jīng)在基因功能研究中廣泛應(yīng)用［9］。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)將3條靶序列共轉(zhuǎn)染入H9c2細(xì)胞，以減少單一siRNA脫靶失效的幾率，效率最大化的特異性沉默AMPKα2在H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMPKα2表達(dá)被抑制后，Cl－－free對(duì)心肌細(xì)胞A/R損傷的保護(hù)作用被取消，并且ROS生成再度升高，氧化應(yīng)激損害加重。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pSuper－AMPKα2 shRNA，并證實(shí)了 Cl－－free可以對(duì)抗心肌細(xì)胞 A/R損傷，其機(jī)制與AMPKα2抑制ROS生成、降低氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

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