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    胰腺癌相關(guān)糖尿病的血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析

    2012-11-07 02:38:46吳健婷田字彬丁雪麗荊雪江月萍魏良洲孔心涓張翠萍趙清喜
    中華胰腺病雜志 2012年5期
    關(guān)鍵詞:診斷模型胰腺癌標(biāo)志物

    吳健婷 田字彬 丁雪麗 荊雪 江月萍 魏良洲 孔心涓 張翠萍 趙清喜

    ·論著·

    胰腺癌相關(guān)糖尿病的血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析

    吳健婷 田字彬 丁雪麗 荊雪 江月萍 魏良洲 孔心涓 張翠萍 趙清喜

    目的檢測(cè)胰腺癌相關(guān)糖尿病的血清蛋白標(biāo)志物,并建立診斷模型。方法應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測(cè)17例胰腺癌相關(guān)糖尿病與17例新發(fā)2型糖尿病、17例健康對(duì)照者血清的差異表達(dá)蛋白,用Biomarker Patterns Software 5.0軟件建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型并驗(yàn)證。結(jié)果在胰腺癌相關(guān)糖尿病、新發(fā)2型糖尿病、健康者各10例的蛋白指紋圖譜中篩選出12個(gè)差異表達(dá)蛋白峰,其中質(zhì)荷比為6116、6695、8936 Da的蛋白峰被選為建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型的蛋白峰。該診斷模型的診斷正確率為90%。盲法驗(yàn)證各組另7例樣本,正確診斷胰腺癌相關(guān)糖尿病患者達(dá)100%,新發(fā)2型糖尿病患者為71%,健康人群為86%。經(jīng)檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),與以上3種差異表達(dá)蛋白分子質(zhì)量最為接近的蛋白分別為金屬硫蛋白、胰腺干細(xì)胞增殖分化因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1。結(jié)論通過(guò)SELDI方法篩選出3種胰腺癌相關(guān)糖尿病的血清蛋白標(biāo)志物,建立了可靠的胰腺癌相關(guān)糖尿病的診斷模型。

    糖尿病; 胰腺腫瘤; 蛋白質(zhì)組學(xué); 表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)

    有學(xué)者[1-3]認(rèn)為,新發(fā)糖尿病(病程≤2年)是胰腺癌的早期臨床表現(xiàn),可將新發(fā)糖尿病患者作為篩查胰腺癌的高危人群。但新發(fā)糖尿病中,多數(shù)為新發(fā)的2型糖尿病,只有較少部分由胰腺癌引起,稱為胰腺癌相關(guān)糖尿病。若在新發(fā)糖尿病患者中篩查出胰腺癌相關(guān)糖尿病,則有可能實(shí)現(xiàn)胰腺癌的早期診斷。本研究比較胰腺癌相關(guān)糖尿病患者與相應(yīng)對(duì)照患者的血清蛋白質(zhì)譜差異,篩選胰腺癌相關(guān)糖尿病的血清蛋白標(biāo)志物,以期為胰腺癌相關(guān)糖尿病的鑒別診斷和發(fā)病機(jī)制的探討提供依據(jù)。

    材料與方法

    一、臨床資料

    2011年5月至2011年12月間采集青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的17例胰腺癌相關(guān)糖尿病、17例不合并糖尿病的胰腺癌、5例胰腺癌合并長(zhǎng)期糖尿病、17例新發(fā)2型糖尿病患者及17例在體檢中心體檢的健康者全血標(biāo)本5 ml,立即放入4℃冰箱靜置3 h,4℃離心取血清,按每管50 μl分裝后置-80℃冰箱保存。胰腺癌相關(guān)糖尿病組與其他各組患者的年齡、性別相匹配。胰腺癌診斷均經(jīng)病理檢查證實(shí)。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)1997年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)推薦的標(biāo)準(zhǔn)[4]。胰腺癌相關(guān)糖尿病:胰腺癌合并病程≤2年的糖尿病。新發(fā)2型糖尿?。翰〕獭?年的2型糖尿病,且除外胰腺癌可能。長(zhǎng)期糖尿病:病程>5年的2型糖尿病,且除外胰腺癌可能。

    二、血清蛋白指紋圖譜檢測(cè)

    采用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測(cè)。具體操作:將血清冰浴融化后置4℃ 10 000 r/min離心2 min,取血清10 μl,加入20 μl U9緩沖液(9 mol/L尿素、20 g/L CHAPS、10 g/L DTT、50 mmol/L Tris-HCL,pH9.0),充分混勻振蕩30 min,加入50 mmol/L NaAc(pH4.0)370 μl,混勻。取50 g/L的弱陽(yáng)離子WCX型納米磁珠(北京賽爾迪生物技術(shù)有限公司)50 μl,加入PCR管中,加入100 μl NaAc混勻、活化5 min后于磁性分離板上放置2 min,棄上清液,重復(fù)上述操作1次。

    每份棄上清液活化的磁珠中加入100 μl處理好的血清樣本,充分振蕩混勻,室溫孵育30 min,磁性分離板上放置1 min,棄上清液。用100 μl NaAc洗脫2次,每次5 min,加入10 μl TFA洗脫結(jié)合在磁珠上的血清蛋白。5 min后取5 μl蛋白洗脫液,加入5 μl SPA,充分混勻后吸取2 μl混合液點(diǎn)樣于金芯片(Au Chip),自然晾干。

    應(yīng)用PBSⅡ-C蛋白質(zhì)芯片時(shí)間飛行質(zhì)譜儀(美國(guó)Ciphergen公司)檢測(cè)血清蛋白。設(shè)定最高檢測(cè)分子質(zhì)量為50 000,優(yōu)化范圍為1500~20 000,激光強(qiáng)度為260,檢測(cè)敏感度為8。濾去分子質(zhì)量10 000以下的峰,以免基質(zhì)峰對(duì)結(jié)果造成干擾。檢測(cè)前用All-in-one多肽標(biāo)準(zhǔn)芯片校正儀器,系統(tǒng)質(zhì)量偏差≤0.1%。

    三、胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型建立

    采用Biomarker Patterns Software5.0識(shí)別診斷胰腺癌相關(guān)性糖尿病的最佳標(biāo)志物,建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型。對(duì)建立診斷模型的差異蛋白峰進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索(http://us.expasy.org/tools/tagident.html),以尋找與其分子質(zhì)量最為接近的蛋白質(zhì)。

    四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用Ciphergen proteinchip3.1分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù),不同組之間蛋白峰峰值的差異采用Biomarker Wizard行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、胰腺癌相關(guān)糖尿病組與其他各組的蛋白指紋圖譜的比較

    胰腺癌相關(guān)糖尿病組與胰腺癌合并長(zhǎng)期糖尿病組、胰腺癌不合并糖尿病組、新發(fā)2型糖尿病組、健康對(duì)照組的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜見(jiàn)圖1。胰腺癌相關(guān)糖尿病組的質(zhì)荷比為8455 Da的蛋白峰表達(dá)顯著高于其他各組(P<0.05)。

    1、2:胰腺癌相關(guān)糖尿病;3、4:胰腺癌不合并糖尿??;5:胰腺癌合并長(zhǎng)期糖尿??;6、7:新發(fā)糖尿?。?、9:健康對(duì)照

    圖1胰腺癌相關(guān)糖尿病組與其他各組的蛋白指紋圖譜

    二、胰腺癌相關(guān)糖尿病組與新發(fā)2型糖尿病組、健康對(duì)照組的比較

    按數(shù)字表法在胰腺癌相關(guān)糖尿病組、新發(fā)2型糖尿病組、健康對(duì)照組中各選取10例組成建模組,發(fā)現(xiàn)12個(gè)蛋白峰峰值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1),其中質(zhì)荷比為6116、6695、8936 Da的蛋白峰被選為建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型的蛋白峰。各組質(zhì)荷比為6116 Da的蛋白峰見(jiàn)圖2。

    質(zhì)荷比(M/Z)胰腺癌相關(guān)糖尿病新發(fā)2型糖尿病健康對(duì)照P值6116a3.23±1.6532.00±1.236.45±2.620.00085591218.39±17.2215.34±13.4158.50±27.890.001076695a1.99±0.990.90±0.301.76±0.770.0040281367.47±5.8011.15±12.903.10±1.330.007248936a10.83±5.668.44±5.614.70±2.840.0081916819.75±5.196.24±3.1313.14±5.420.0103729583.25±3.203.17±3.258.10±4.530.0128855500.86±0.820.60±0.311.63±0.810.01413332940.30±0.120.41±0.310.76±0.490.0206565011.51±1.310.93±0.342.07±1.040.0318617422.18±1.411.73±1.774.42±3.520.04444116684.58±2.485.91±3.492.85±1.920.04692

    注:a被選為建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型的蛋白峰

    1、2:胰腺癌相關(guān)糖尿??;3、4:新發(fā)2型糖尿??;5、6:健康對(duì)照

    三、胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型流程

    以6116 Da蛋白為節(jié)點(diǎn) 1,將30例中峰值>5.94的7例劃分到終節(jié)點(diǎn)4中,為健康人群;峰值≤5.94的23例樣本再以6695 Da蛋白為節(jié)點(diǎn)2繼續(xù)劃分,峰值≤1.24的11例劃分到終節(jié)點(diǎn)1中,診斷為新發(fā)2型糖尿??;峰值>1.24的12例以8936 Da蛋白為節(jié)點(diǎn)3繼續(xù)劃分,峰值≤3.52的2例劃分到終節(jié)點(diǎn)2中,為健康人群,峰值>3.52的10例劃分到終節(jié)點(diǎn)3中,診斷為胰腺癌相關(guān)糖尿病(圖3)。其診斷ROC曲線見(jiàn)圖4。

    紅色條為健康對(duì)照,藍(lán)色條為新發(fā)糖尿病,綠色條為胰腺癌相關(guān)糖尿病

    圖3胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型圖

    圖4 胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型ROC曲線

    四、診斷模型的盲法驗(yàn)證

    采用已建立的診斷模型對(duì)建模組30例及另21例蛋白指紋圖譜進(jìn)行盲法驗(yàn)證,結(jié)果顯示建模組30例的診斷正確率均達(dá)90%,另21例中胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷率為100%,新發(fā)糖尿病診斷準(zhǔn)確率為71%,健康人群為86%(表2)。

    表2 診斷模型的盲法驗(yàn)證結(jié)果

    五、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢

    對(duì)建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型的3個(gè)差異蛋白峰分別進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,6116 Da蛋白與金屬硫蛋白(6115 Da)的分子質(zhì)量最為接近,8936 Da蛋白與胰腺干細(xì)胞增殖分化因子(8933 Da)的分子質(zhì)量最為接近,6695 Da蛋白與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1(FGF1,6698 Da)的分子質(zhì)量最為接近。

    討 論

    胰腺癌的早期診斷一直是臨床工作中亟待解決的問(wèn)題,目前常用的胰腺癌血清學(xué)標(biāo)志物因其靈敏性和特異性欠佳,不能滿足早期診斷胰腺癌的需要。近年來(lái),以新發(fā)糖尿病為胰腺癌高危人群,從中篩查胰腺癌相關(guān)糖尿病為胰腺癌的早期診斷提供了新的思路。目前關(guān)于胰腺癌相關(guān)糖尿病發(fā)病機(jī)制主要是胰腺癌釋放的可溶性介質(zhì)干預(yù)胰島β細(xì)胞功能,影響肝臟、肌肉的糖代謝過(guò)程,引起胰島素抵抗,最終導(dǎo)致胰腺癌相關(guān)糖尿病的發(fā)生[5]。對(duì)于可溶性介質(zhì)的研究主要集中在體外細(xì)胞培養(yǎng)、組織標(biāo)本檢測(cè)、基因組學(xué)研究等方面。

    近年來(lái),蛋白質(zhì)組學(xué)得到迅速發(fā)展。SELDI是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)之一,在腫瘤標(biāo)志物的探索方面得到廣泛應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn),在胰腺癌相關(guān)糖尿病組與新發(fā)2型糖尿病組、健康對(duì)照組間有12個(gè)蛋白峰峰值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中6116、8936和6695 Da的蛋白峰為診斷胰腺癌相關(guān)糖尿病的最佳標(biāo)志物。以此為依據(jù)建立的診斷模型診斷正確率為90%。盲法驗(yàn)證顯示,該模型可正確劃分100%的胰腺癌相關(guān)糖尿病患者、71%的新發(fā)糖尿病患者和86%的健康人群。本研究還顯示,質(zhì)荷比為8455 Da的蛋白峰在胰腺癌相關(guān)糖尿病組與其他組的差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但在建模組間未發(fā)現(xiàn)顯著差異,其原因有待進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量后驗(yàn)證。

    6116 Da蛋白峰與金屬硫蛋白分子質(zhì)量最為接近。研究發(fā)現(xiàn),金屬硫蛋白具有清除自由基、減輕高血糖及脂肪酸的細(xì)胞毒性、改善胰島素抵抗從而延緩糖尿病發(fā)生的作用[6]。8936 Da蛋白峰與胰腺干細(xì)胞增殖分化因子與的分子質(zhì)量最為接近。6695 Da蛋白與FGF1蛋白的分子質(zhì)量最為接近,F(xiàn)GF1可改善胰島β細(xì)胞功能,促進(jìn)胰島素分泌,促進(jìn)脂肪合成[7]。本實(shí)驗(yàn)顯示,胰腺癌相關(guān)糖尿病患者血清6116 Da、6695 Da蛋白表達(dá)下調(diào),8936 Da蛋白表達(dá)上調(diào),它們參與胰腺癌相關(guān)糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

    由于本實(shí)驗(yàn)采用SELDI技術(shù),它所得到的每一個(gè)波峰值對(duì)應(yīng)的可能是多個(gè)分子質(zhì)量相近的蛋白質(zhì)或多肽,因此,并不能對(duì)目標(biāo)蛋白做直接鑒定,依據(jù)其分子質(zhì)量在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索所得結(jié)果只是一種可能性猜測(cè),因此對(duì)所篩選到的差異表達(dá)蛋白尚需進(jìn)一步明確。

    [1] Pannala R, Basu A, Petersen GM, et al. New-onset diabetes:a potential clue to the early diagnosis of pancreatic cancer. Lancet Oncol,2009,10:88-95.

    [2] Ben Q, Cai Q, Li Z, et al.The relationship between new-onset diabetes mellitus and pancreatic cancer risk:a case-control study. Eur J Cancer,2011,47:248-254.

    [3] Chari ST, Leibon CL,Rabe KG,et al.Pancreatic cancer-associated diabetes mellitus: prevalence and temporal association with diagnosis of cancer. Gastroenterology,2008,134:95-101.

    [4] Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus.Diabetes care,1997,20:1183-1197.

    [5] Chari ST,Zapiach M,Yadav D,et al.Beta-cell function and insulin resistance evaluated by HOMA in pancreatic cancer subjects with varying degrees of glucose intolerance.Pancreatology,2005,5:229-233.

    [6] Park L, Min D, Kim H,et al.Tat-enhanced delivery of metallothionein can partially prevent the development of diabetes.Free Radic Biol Med,2011,51:1666-1674.

    [7] Hart AW, Baeza N, Apelqvist A,et al.Attenuation of FGF signaling in mouse β-cells leads to diabetes.Nature,2000,408:864-868.

    Serumproteomicanalysisofpancreaticcancerassociateddiabetes

    WUJian-ting,TIANZi-bin,DINGXue-li,JINGXue,JIANGYue-ping,WEILiang-zhou,KONGXin-juan,ZHANGCui-ping,ZHAOQing-xi.

    DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266003,China

    TIANZi-bin,Email:tianzb@qdumh.qd.sd.cn

    ObjectiveTo detect serum biomarkers for pancreatic cancer associated diabetes and establish a model for diagnosis.MethodsSELDI-TOF-MS was used to detect the differentially expressed serum proteins from 17 pancreatic cancer associated diabetes patients, 17 new-onset type Ⅱ diabetes patients and 17 healthy controls, then a model of biomarkers was constructed and validated by Biomarker Patterns Software 5.0.ResultsTwelve discriminating m/z peaks were identified in the protein fingerprints in 10 pancreatic cancer associated diabetes patients, 10 new-onset type Ⅱ diabetes patients and 10 healthy controls. Among them, the three biomarkers of mass/charge ratio 6116, 6695 and 8936 were used to construct the model, which could diagnose 90% pancreatic cancer associated diabetes form control groups. Blind test of other 7 samples of three groups showed that 100% pancreatic cancer associated diabetes, 71% new-onset diabetes and 86% healthy controls were correctly classified. After searching protein database, there were metallothionein, pancreatic progenitor cell differentiation and proliferation factor-like protein, and fibroblastic growth factor 1, which were close to the weights of the above mentioned 3 differentially expressed proteins.ConclusionsSELDI can identify 3 biomarkers for pancreatic cancer associated diabetes and a reliable model for diagnosis of pancreatic cancer associated diabetes is established.

    Diabetes mellitus; Pancreatic neoplasms; Proteomics; SELDI-TOF-MS

    10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.005

    266003 青島,青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

    田字彬,Email:tianzb@qdumh.qd.sd.cn

    2012-05-23)

    (本文編輯:呂芳萍)

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