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    胰腺導(dǎo)管腺癌microRNA表達(dá)譜的研究

    2012-11-07 02:41:39張晶趙晨燕劉清華余黨會陳穎史敏倪燦榮朱明華
    中華胰腺病雜志 2012年5期
    關(guān)鍵詞:胰腺癌探針腺癌

    張晶 趙晨燕 劉清華 余黨會 陳穎 史敏 倪燦榮 朱明華

    ·論著·

    胰腺導(dǎo)管腺癌microRNA表達(dá)譜的研究

    張晶 趙晨燕 劉清華 余黨會 陳穎 史敏 倪燦榮 朱明華

    目的應(yīng)用microRNA(miRNA)高通量生物芯片篩選胰腺導(dǎo)管腺癌及癌旁組織差異表達(dá)的miRNA,分析其相關(guān)的靶基因。方法收集9例新鮮的胰腺導(dǎo)管腺癌和3例癌旁組織,運(yùn)用標(biāo)記713個miRNA的Agilent miRNA生物芯片篩選胰腺導(dǎo)管腺癌差異表達(dá)的miRNA,應(yīng)用熒光實時定量PCR方法驗證表達(dá)上調(diào)的miRNA。采用TargetScan 5.1和miRandaV5分析軟件分析差異表達(dá)miRNAs的靶基因。結(jié)果miRNA芯片篩選出11個胰腺導(dǎo)管腺癌相關(guān)的差異表達(dá)的miRNA,其中miR-194*、miR-192*、miR-602、miR-194表達(dá)上調(diào),miR-139-3p、miR-513a-5p、miR-630、miR-30c-1*、miR-887、miR-508-5p、miR-516a-5p表達(dá)下調(diào)。miR-192、miR-194及其同源體的表達(dá)在31例胰腺癌組織中得到驗證。經(jīng)軟件分析,miR-192靶基因有ZEB2、CXCL-2、EEF1A1、ERCC3,miR-192*靶基因有DCC、SMAD4、FAS,miR-194靶基因有DACH1、IGSF11、PTPN2、RBBP4,miR-194*靶基因有CD40LG、CIDEB、FHL1。結(jié)論胰腺導(dǎo)管腺癌存在11個表達(dá)差異的miRNA,這些miRNA可能與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

    胰腺腫瘤; 微RNAs; 微陣列分析; 基因表達(dá)譜

    MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為19~23 nt的、廣泛存在于動植物體內(nèi)的、非編碼單鏈RNA。miRNA通過作用于其靶mRNA,降解靶基因或抑制其翻譯,發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。研究表明[1-6],miRNA參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程,包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖及分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等,還具有癌基因和抑癌基因的作用。在不同類型的腫瘤中有其特異的miRNA表達(dá)譜。本研究采用miRNA芯片技術(shù)篩選胰腺導(dǎo)管腺癌與癌旁正常胰腺組織差異表達(dá)的miRNA,并分析其相關(guān)靶基因。

    材料與方法

    一、組織標(biāo)本

    收集2007年至2008年長海醫(yī)院外科切除的9例胰腺癌組織標(biāo)本及3例配對的癌旁正常胰腺標(biāo)本送上海生物芯片有限公司行miRNA芯片檢測,其中男性4例,女性5例,年齡47~75歲。另取2009年3月至2010年5月手術(shù)切除的31例胰腺癌及配對的癌旁新鮮組織標(biāo)本,液氮冷凍后置-80℃保存,行實時定量PCR;其中男性15例,女性16例,年齡45~77歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行抗腫瘤治療,均簽署知情同意書,并經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有標(biāo)本經(jīng)病理檢查均證實為胰腺導(dǎo)管腺癌。

    二、miRNA芯片檢測

    應(yīng)用miRNA抽提試劑盒(Ambion, AM1560)抽提新鮮組織的mRNA,并富集miRNA。應(yīng)用miRNA標(biāo)記和雜交試劑盒(Agilent 5190-0408)對miRNA進(jìn)行CY3熒光標(biāo)記。miRNA微陣列基因芯片和質(zhì)控探針由上海生物芯片有限公司提供(Agilnent公司產(chǎn)品),其miRNA探針序列信息來自于SangermiRBase Release10.0版本數(shù)據(jù)庫(http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/),涵蓋了Sanger數(shù)據(jù)庫中713個miRNA探針。每張芯片都設(shè)計了與實驗樣品無同源性的核酸序列作為質(zhì)控RNA。組織標(biāo)本預(yù)處理及探針雜交按Agilent芯片實驗操作步驟進(jìn)行。設(shè)空白對照及采用與實驗樣品無同源性的核酸序列探針的陰性對照組。芯片的每個探針雜交位點(diǎn)至少有3個重復(fù)。

    采用Agilent掃描儀掃描采集雜交圖像,采用Feature Extraction軟件讀取圖像數(shù)據(jù),最后采用Feature Extraction進(jìn)行處理分析,得到的原始數(shù)據(jù)通過VSN(variance stabilizing normalization)方法進(jìn)行歸一化。

    三、熒光實時定量PCR

    應(yīng)用miRNA抽提試劑盒抽提31例配對的胰腺導(dǎo)管腺癌和癌旁胰腺組織miRNAs,應(yīng)用TaqMan microRNA reverse transcription試劑盒將miRNAs逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,應(yīng)用TaqMan microRNA assays檢測miRNAs的表達(dá)。PCR反應(yīng)條件:95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 34 s,40個循環(huán)。以U6 SnRNA作為內(nèi)參照,采用△CT方法計算miRNA的相對表達(dá)量。

    四、差異miRNA靶基因及其相關(guān)疾病分析

    采用生物信息學(xué)分析方法。應(yīng)用TargetScan5.1和miRandaV5分析軟件預(yù)測并初步分析差異表達(dá)miRNAs的靶基因,并分析與其相關(guān)的疾病。

    五、統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、胰腺導(dǎo)管腺癌組織中差異表達(dá)的miRNA

    miRNA芯片雜交信號強(qiáng)度由綠-黑-紅色依次增加。胰腺導(dǎo)管腺癌組織中差異表達(dá)≥1.2倍的miRNA共12個,其中5個上調(diào),為miR-194*、miR-192*、miR-602、miR-801、miR-194;7個下調(diào),為miR-139-3p、miR-513a-5p、miR-630、miR-30c-1*、miR-887、miR-508-5p、miR-516a-5p(表1)。因miR-801被證實不是真正的miRNA,而是一個U11RNA的片段,故在聚類分析中被剔除(圖1)。上調(diào)最高的miRNA為miR-194*,上調(diào)倍數(shù)為2.38倍。

    表1 胰腺導(dǎo)管腺癌中差異表達(dá)的miRNAs

    注:帶*號的miRNA與其相應(yīng)的miRNA來自同一前體

    圖1 差異表達(dá)的miRNAs聚類分類圖

    二、胰腺癌組織miR-192、miR-192*、miR-194和miR-194*表達(dá)的驗證

    31例胰腺導(dǎo)管腺癌和配對癌旁胰腺組織的miR-192、miR-192*、miR-194和miR-194*表達(dá)均顯著上調(diào)(P值均<0.05,表2)。

    miRNA胰腺癌組織癌旁組織P值miR-192-0.66±4.08-5.49±7.140.001miR-192*-6.63±4.97-8.98±3.510.010miR-194-1.56±4.15-6.51±7.790.001miR-194*-9.35±5.51-11.95±2.860.022

    三、差異表達(dá)miRNA的靶基因及其相關(guān)疾病

    miR-192靶基因有ZEB2、CXCL-2、EEF1A1,miR-192*靶基因有DCC、SMAD4、FAS,miR-194靶基因有DACH1、IGSF11、PTPN2、RBBP4,miR-194*靶基因有CD40LG、CIDEB、FHL1。相關(guān)的疾病見表3。

    表3 差異表達(dá)miRNA的靶基因及相關(guān)疾病

    討 論

    人類約50%已知的miRNAs基因定位于與腫瘤相關(guān)的染色體區(qū),提示其在腫瘤發(fā)生中具有重要作用[6]。在慢性淋巴細(xì)胞性白血病、兒童Burkitt淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤中,miRNAs表達(dá)均發(fā)生顯著變化[7-14],并可抑制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。2006年Volinia等[15]報道,胰腺癌中異常高表達(dá)的miRNA有55個,低表達(dá)的miRNA有2個。隨后,Lee、Bloomston及Szafanska等[16-18]檢測了胰腺癌、癌旁組織、慢性胰腺炎組織中miRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)胰腺癌中異常高表達(dá)的miRNA有miR-155、miR-21、miR-221、miR-222、miR-196a等,異常低表達(dá)的有miR-181、miR-148、miR-216和miR-217等。Szafanska等[18]還發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)譜可用于鑒別胰腺癌、慢性胰腺炎和正常胰腺。

    本研究應(yīng)用Agilent miRNA芯片篩選出胰腺導(dǎo)管腺癌表達(dá)上調(diào)的miRNA 4個,下調(diào)的miRNA 7個,其中miR-192*和miR-194*上調(diào)大于1.8倍。通過胰腺癌組織標(biāo)本的檢測,證實了miRNA芯片的結(jié)果。

    Mees等[19]在miRNA上游轉(zhuǎn)錄因子的研究中發(fā)現(xiàn),高侵襲、高轉(zhuǎn)移的胰腺癌細(xì)胞株中miR-194的水平明顯高于侵襲力和浸潤、轉(zhuǎn)移能力較差的胰腺癌細(xì)胞株。Meng等[20]發(fā)現(xiàn)miR-194在肝上皮細(xì)胞中高表達(dá),它可作為肝上皮細(xì)胞的標(biāo)志物,并能抑制小鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。miR-194也表達(dá)于胃腸道和腎臟,但肝臟枯否細(xì)胞和星狀細(xì)胞無高表達(dá)。

    通過靶基因預(yù)測軟件檢索,miR-194的靶基因有DACH1。DACH1蛋白是黑腹果蠅dachshund(Dac)基因在脊椎動物中表達(dá)的類似物,是一種新型的抑癌基因,它通過阻斷腫瘤上皮細(xì)胞的DNA合成、抑制腫瘤基質(zhì)層中腫瘤集落的形成和腫瘤細(xì)胞的有絲分裂達(dá)到阻止腫瘤細(xì)胞增殖的目的。有研究[21]證明SIP1為miR-192的靶基因。Kato等[22-23]研究發(fā)現(xiàn),miR-192在纖維化的腎臟高度特異性表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的蓄積;并通過雙熒光素檢測確定SIPl的3′UTR為miR-192調(diào)控靶點(diǎn),證明miR-192通過mRNA降解途徑降低SIPl蛋白的表達(dá)。我們的結(jié)果并沒有顯示SIP1為miR-192的靶基因,這可能與生物信息學(xué)分析的方法不同、生物信息學(xué)分析與實驗檢測存在一定的差異有關(guān)。

    [1] Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.Nature, 2000, 403:901-906.

    [2] Brennecke J, Hipfner DR, Stark A, et al. Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila.Cell, 2003, 113:25-36.

    [3] Xu P, Vernooy SY, Guo M, et al. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr Biol, 2003, 13:790-795.

    [4] Dostie J,Mourelatos Z,Yang M,et al.Numerous microRNPs in neuronal cells containing novel microRNAs.RNA,2003,9:180-186.

    [5] Chen CZ, Li L, Lodish HF, et al. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science, 2004,303:83-86.

    [6] Calin GA, Sevignani C,Dumitru CD, et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101:2999-3004.

    [7] Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13ql4 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:15524-15529.

    [8] He L, Thomson JM ,Hemann MT, et al. A microRNA palycistron as a potential human oncogene.Nature, 2005,435:828-833.

    [9] Hanck L, von Harsdorf R. E2F transcription factors and pRb pocket proteins in cell cycle progression. Methods Mol Biol, 2005, 296:239-245.

    [10] van den BergA, Kroesen BJ, Kooistra K, et al. High expression of B-cell receptor inducible gene BIC in all subtypes of Hodgkin lymphoma. Genes Chromosomes Cancer, 2003, 37:20-28.

    [11] Metzler M, Wilda M, Busch K, et al. High expression of precursor microRNA-155/BIC RNA in children with Burkitt lymphoma.Genes Chromosomes Cancer, 2004, 39:167-169.

    [12] Eis PS, Tam W, Sun L, et al. Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102:3627-3632.

    [13] Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, et al. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res, 2004, 64:3753-3756.

    [14] Hayashita Y, Osada H, Tatematsu Y, et al. A polycistronic microRNA cluster, miR-17-92, is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation. Cancer Res, 2005, 65:9628-9632.

    [15] Volinia S, Calin GA, Liu CG,et al. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103:2257-2261.

    [16] Lee EJ, Gusev Y, Jiang J,et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. Int J Cancer, 2007, 120:1046-1054.

    [17] Bloomston M, Frankel WL, Petrocca F,et al. MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis. JAMA, 2007, 297:1901-1908.

    [18] Szafranska AE, Davison TS, John J,et al. MicroRNA expression alterations are linked to tumorigenesis and non-neoplastic processes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Oncogene, 2007, 26:4442-4452.

    [19] Mees ST, Mardin WA, Wendel C,et al. EP300-a miRNA-regulated metastasis suppressor gene in ductal adenocarcinomas of the pancreas. Int J Cancer, 2010, 126:114-124.

    [20] Meng Z, Fu X, Chen X,et al. miR-194 is a marker of hepatic epithelial cells and suppresses metastasis of liver cancer cells in mice. Hepatology, 2010, 52:2148-2157.

    [21] Wang B, Herman-Edelstein M, Koh P, et al. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-beta. Diabetes, 2010, 59:1794-1802.

    [22] Kato M, Zhang J, Wang M,et al. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruli and its function in TGF-beta-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104:3432-3437.

    [23] Kato M, Arce L, Wang M,et al. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int,2011,80:358-368.

    MicroRNAprofilesinpancreaticductaladenocarcinoma

    ZHANGJing,ZHAOChen-yan,LIUQing-hua,YUDang-hui,CHENYing,SHIMin,NICan-rong,ZHUMing-hua.

    DepartmentofPathology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

    ZHUMing-hua,Email:mhzhu2000@hotmail.com

    ObjectiveTo study the differentially expressed microRNA (miRNA) between pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and para-cancerous tissues, and determine related target genes.MethodsNine fresh PDAC tumor tissues and 3 adjacent normal pancreatic tissues were collected, then Agilent miRNA microarray with 713 miRNA loci was used to identify the differentially expressed miRNA. Real-time PCR method was applied to verify the up-regulated miRNA. TargetScan 5.1 and miRandaV5 software were used to analyze the related target genes.ResultsmiRNA microarray identified 11 PDAC related miRNAs, among them, the expressions of miR-194*, miR-192*, miR- 602, miR-194 were up-regulated, while the expressions of miR-139-3p, miR-513a-5p, miR-630, miR-30c-1*, miR-887, miR-508-5p, miR-516a-5p were down-regulated. The expressions of miR-192, miR-194 and their homolog were verified in 31 PDAC tumor tissues. After software analysis, it was found that target genes of miR-192 were ZEB2, CXCL-2, EEF1A1, ERCC3, and target genes of miR-192* were DCC, SMAD4, FAS, and target genes of miR-194 included DACH1, IGSF11, PTPN2, RBBP4, while target genes of miR-194* included CD40LG, CIDEB, FHL1.ConclusionsEleven differentially expressed miRNAs are present in PDC, and they may be involved in the occurrence and development of PDC.

    Pancreatic neoplasms; MicroRNA; Microarray analysis; Gene expression profiling

    10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.007

    國家自然科學(xué)基金(30770996;81172310)

    200433 上海,第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院病理科(張晶、劉清華、余黨會、陳穎、史敏、倪燦榮、朱明華);復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科(趙晨燕)

    共同第一作者:趙晨燕

    朱明華,Email:mhzhu2000@hotmail.com

    2012-06-13)

    (本文編輯:屠振興)

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