蔡篤雄 陳衛(wèi)昌 曾仕平 湯凈

羅格列酮對(duì)急性壞死性胰腺炎及其肺損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

蔡篤雄 陳衛(wèi)昌 曾仕平 湯凈

重癥急性胰腺炎(series acute pancreatitis,SAP)是臨床上常見的危重疾病，病情進(jìn)展迅速，病死率高。因此，早期對(duì)SAP發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)因素進(jìn)行干預(yù)可能成為治療SAP的重要措施。

本研究應(yīng)用過氧化物酶增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARγ)激動(dòng)劑羅格列酮干預(yù)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，探討羅格列酮對(duì)ANP及其肺損傷的保護(hù)作用。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康SD大鼠72只，體重200～250 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(SCXK湘2009-0004)。按完全隨機(jī)法分為ANP組、羅格列酮組(干預(yù)組)及假手術(shù)組，每組24只。采用胰膽管逆行注入5%牛磺膽酸鈉0.1 ml/100 g體重(Sigma公司)方法建立ANP模型，羅格列酮組于制模前30 min腹腔內(nèi)注射羅格列酮10 mg/kg體重(天津葛蘭素史克公司)。假手術(shù)組開腹后僅翻動(dòng)胰腺即關(guān)腹。分別于術(shù)后3、6、12 h腹主動(dòng)脈抽血后處死大鼠，留取胰腺及肺組織。

2．血淀粉酶、TNF-α、IL-6、氧分壓(PaO2)檢測(cè)：血漿淀粉酶采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；PaO2采用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)；血漿TNF-α、IL-6采用ELISA法檢測(cè)，試劑盒購自北京晶美生物工程公司，按說明書操作。

3．胰腺及肺組織病理檢查：按常規(guī)操作。

4．胰腺組織PPARγ mRNA和熱休克蛋白70(HSP-70)mRNA及肺組織TNF-α、黏附分子1(ICAM-1) mRNA表達(dá)檢測(cè)：采用RT-PCR法。PPARγ正義5′-TGACCACTCCCATTCCTTTG-3′，反義5′-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT-3′，產(chǎn)物335 bp；HSP-70正義5′-GCTGACCAAGATGAAGGAGATC-3′，反義5′-GAGTCG-ATCTCCAGGCTGGC-3′，產(chǎn)物645 bp；TNF-α正義 5′-CTCAAAGACAACCAACTGGTGGTAC-3′，反義 5′-ACAGAGCAATGACTCCAAAGTAGACC-3′，產(chǎn)物312 bp；ICAM-1正義5′-ACCACAGCTGACAGGGAAATCG-3′，反義5′-AGAGGTCTTTACGCATGTCAACG-3′，產(chǎn)物282 bp。以β-actin(221 bp)為內(nèi)參。引物由上海生工生物工程公司合成。反應(yīng)條件： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s或1 min，50℃(PPARγ)或55℃(ICAM-1)或58℃(HSP-70)或60℃(TNF-α) 1 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃7 min，4℃放置。產(chǎn)物電泳分離后掃描，以目的條帶與β-actin的灰度比值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．血淀粉酶、TNF-α、IL-6、PaO2水平的變化：ANP組血淀粉酶、TNF-α、IL-6及PaO2水平較假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P<0.05或<0.01)；干預(yù)組淀粉酶、TNF-α及IL-6水平均較ANP組同時(shí)間點(diǎn)明顯降低(P<0.05或<0.01)，6、12 h點(diǎn)的PaO2較ANP組明顯升高(P<0.05，表1)。

2．胰腺及肺組織病理改變：假手術(shù)組胰腺及肺組織無明顯病理改變。ANP組3 h時(shí)胰腺腺泡水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，可見局灶性腺泡細(xì)胞變性壞死，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病變呈進(jìn)行性加重；干預(yù)組胰腺水腫、出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較ANP組減輕。ANP組3 h時(shí)肺泡壁水腫，肺間質(zhì)中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病變逐漸加重；干預(yù)組肺泡壁、肺間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較ANP組明顯減輕(圖1)。

3．胰腺組織PPARγ、HSP-70 mRNA表達(dá)：干預(yù)組胰腺PPARγ、HSP-70 mRNA表達(dá)較假手術(shù)組及ANP組均顯著增強(qiáng)(P<0.05或<0.01)，而假手術(shù)組和ANP組間PPARγ mRNA表達(dá)無顯著差異。ANP組6、12 h點(diǎn)胰腺HSP-70 mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加(P值均<0.05，圖2，表2)。

組別 時(shí)間(h)只數(shù)淀粉酶(U/L)TNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)PaO2(mmHg)假手術(shù)組381434±58.58±94.21±93.5±123 14.9014.272.4681641±63.19±92.19±92.4±683 16.6811.483.91281604±58.21±99.64±91.0±457 15.4018.236.5ANP組 384160±83.32±121.81±85.1±618b18.22a14.94b5.5b685194±106.49±132.49±77.9±1603b 29.13b23.76b6.0b1285875±96.38±146.01±68.6±1149b 20.98b18.61b7.4b干預(yù)組 383392±64.68±106.98±89.5±410bd19.46c11.24c5.0683585±83.64±110.71±85.4±1893c 15.96c17.52c7.1ac1284517±70.43±123.58±79.6±1493c 21.30c18.13ac11.7ac

注：與假手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)比較，aP<0.05，bP<0.01與ANP組同時(shí)點(diǎn)比較，cP<0.05,dP<0.01。1 mm Hg=0.133 kPa

圖1對(duì)照組(a)、ANP組(b)、干預(yù)組(c)大鼠12 h時(shí)胰腺(上)和肺(下)組織的病理改變(HE ×100)

1：對(duì)照組；2：ANP組；3：干預(yù)組

4．肺組織TNF-α、ICAM-1 mRNA表達(dá)：假手術(shù)組肺組織TNF-α mRNA及ICAM-1 mRNA均呈微弱表達(dá)，ANP組的表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加(P<0.01)，干預(yù)組又較ANP組顯著降低(P<0.05，表2，圖3)。

組別時(shí)點(diǎn)(h)只數(shù)PPARγmRNAHSP-70mRNATNF-αmRNAICAM-1mRNA對(duì)照組380.35±0.42±0.28±0.22±0.060.120.720.43680.37±0.44±0.30±0.24±0.090.110.590.621280.39±0.46±0.27±0.23±0.080.080.560.68ANP組380.33±0.45±0.51±0.44±0.100.110.66b0.50b680.35±0.58±0.94±0.85±0.560.12a0.91b0.47b1280.37±0.62±0.73±0.92±0.090.12a0.76b0.10b干預(yù)組380.47±0.61±0.43±0.39±0.13ac0.12bc0.58bc0.49bc680.65±0.73±0.81±0.76±0.13bd0.13bc0.12bc0.93bc1280.71±0.80±0.64±0.81±0.09bd0.15bc0.82bc0.13bc

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，aP<0.05，bP<0.01；與ANP組同時(shí)點(diǎn)比較，cP<0.05,dP<0.01

1：對(duì)照3 h組；2：ANP 3 h組；3：干預(yù)3 h組；4：ANP 6 h組；5：干預(yù)6 h組；6：ANP 12 h組；7：干預(yù)12 h組

圖3各組大鼠肺組織TNF-α mRNA(a)及 ICAM-1 mRNA(b)的表達(dá)

討論P(yáng)PARγ是一個(gè)細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，包括抑制IL-1、TNF-α、IL-6的產(chǎn)生及ICAM-1、NF-κB的表達(dá)等。Ivashchenko等[1]的研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮通過激活PPARγ而改善大鼠急性水腫型胰腺炎的病情。Rollins等[2]研究結(jié)果表明，雨蛙素可降低胰腺PPARγ的表達(dá)，使用PPARγ激動(dòng)劑干預(yù)后，能恢復(fù)胰腺PPARγ的表達(dá)水平,PPARγ的表達(dá)與胰腺炎的嚴(yán)重程度和致炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α呈負(fù)相關(guān)。孫俊濤等[3]研究表明，羅格列酮通過激活PPARγ而減輕AP小鼠肝損傷。本研究結(jié)果顯示，羅格列酮處理后ANP大鼠胰腺PPARγ mRNA表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，胰腺損傷減輕，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。

HSP是指細(xì)胞在多種應(yīng)激原，特別是高溫環(huán)境下被應(yīng)激誘導(dǎo)合成的一組蛋白質(zhì)，目前的研究主要集中在HSP70和HSP20。Grisé等[4]研究發(fā)現(xiàn)，高熱預(yù)刺激可誘導(dǎo)胰腺HSP-70表達(dá)，降低AP小鼠血清TNF-α、IL-6水平，減輕胰腺損傷，降低死亡率。Konturek等[5]用雨蛙素誘導(dǎo)大鼠AP模型，應(yīng)用吡格列酮干預(yù)后，胰腺組織炎癥和損傷減輕。本研究中，羅格列酮組胰腺HSP-70 mRNA表達(dá)水平較ANP和假手術(shù)組顯著增加，提示羅格列酮也可能通過誘導(dǎo)HSP-70 mRNA的表達(dá)減輕胰腺的病理損傷。

細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及ICAM-1在ANP及其肺損傷的發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用。Cuzzocrea等[6]研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮通過減少細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生從而改善大鼠急性水腫型胰腺炎的病情。本研究中，羅格列酮組血漿TNF-α、IL-6水平較ANP組顯著降低，從而發(fā)揮抗炎癥效應(yīng)。此外，羅格列酮組肺組織TNF-α、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平較ANP組顯著降低，肺組織病理損傷明顯減輕，動(dòng)脈PaO2升高，提示羅格列酮可能通過減少肺組織TNF-α及ICAM-1的產(chǎn)生從而減輕ANP合并的肺損傷程度。

[1] Ivashchenko CY,Duan SZ,Usher MG, et al.PPAR-gamma knockout in pancreatic epithelial cells abolishes the inhibitory effect of rosiglitazone on caerulein-induced acute pancreatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,293:G319-G326.

[2] Rollins MD,Sudarshan S,Firpo MA,et al.Anti-inflam matory effects of PPAR-gamma agonists directly correlate with PPAR-gamma expression during acute pancreatitis.J Gastrointest Surg,2006,10:1120-1130．

[3] 孫俊濤，許剛，田克立.PPARγ激動(dòng)劑對(duì)急性胰腺炎小鼠肝損傷的影響.中華胰腺病學(xué)雜志,2010,10:138-139.

[4] Grisé K,Kim F,McFadden D.Hyperthermia induces heat-Shock protein expression, reduces pancreatic injury, and improves survival in necrotizing pancreatitis.Pancreas, 2000,21:120-125.

[5] Konturek PC,Dembinski A,Warzecha Z,et al.Pioglitazone，a specific ligand of peroxisome proliferator-activated receptorgamma，protects pancreas against acute cerulein-induced pancreatitis.World J Gastroenterol,2005,11:6322-6329.

[6] Cuzzocrea S,Pisano B,Dugo L,et al.Rosiglitazone,a ligand of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,reduces acute pancreatitis induced by cemlein.Intensive Care Med,2004,30:951-956.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.020

海南省自然科學(xué)基金資助(807093)

570102 海口，海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(蔡篤雄、曾仕平、湯凈)；蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(陳衛(wèi)昌)

陳衛(wèi)昌，Email:weichangchen@126.com

2011-11-28)

(本文編輯：呂芳萍)