冠心病危重病人紅細(xì)胞流變特性和血紅蛋白結(jié)構(gòu)的研究*

郝希平， 岳糧躍， 雷健明， 李周璇， 楊繼旺， 侯增濤， 黃耀熊△

(1暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東 廣州 510632；2河南科技大學(xué)物理與工程學(xué)院,洛陽市光電功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471003；3廣西醫(yī)科大學(xué)物理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

1000-4718(2012)05-0937-05

2011-09-13

2012-03-09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30940019)

△通訊作者 Tel:020-85220469; E-mail: tyxhuang@jnu.edu.cn

冠心病危重病人紅細(xì)胞流變特性和血紅蛋白結(jié)構(gòu)的研究*

郝希平1,2， 岳糧躍3， 雷健明1， 李周璇1， 楊繼旺1， 侯增濤1， 黃耀熊1△

(1暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東 廣州 510632；2河南科技大學(xué)物理與工程學(xué)院,洛陽市光電功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471003；3廣西醫(yī)科大學(xué)物理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

目的研究冠心病危重病人紅細(xì)胞流變特性和血紅蛋白結(jié)構(gòu)的變化。方法利用動(dòng)、靜態(tài)圖像分析技術(shù)和紫外-可見光譜技術(shù)，對pH 7.4生理環(huán)境下冠心病危重病人和健康人的紅細(xì)胞和離體血紅蛋白進(jìn)行測定。結(jié)果(1)冠心病危重病人的青齡、老齡紅細(xì)胞的形態(tài)大小參數(shù)與健康人不同，冠心病危重病人的青齡、老齡紅細(xì)胞的接觸面積、周長、長軸和短軸比健康人小，形狀歸化因子比健康人大。(2)冠心病危重病人的青齡、老齡紅細(xì)胞的彎曲彈性模量比健康人大。(3)冠心病危重病人血紅蛋白的吸收光譜與健康人一致，吸收峰的位置相同，吸收峰的吸收值沒有明顯差異。結(jié)論冠心病危重病人青齡、老齡紅細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)均不同程度向球形過渡，變形能力比健康人下降，但其血紅蛋白結(jié)構(gòu)未呈現(xiàn)與健康人不同的變化。

冠狀動(dòng)脈疾??； 紅細(xì)胞； 血紅蛋白

紅細(xì)胞在體內(nèi)的主要功能是運(yùn)輸氧氣和二氧化碳，即把氧氣從肺部攜帶到全身組織并把二氧化碳從組織攜帶到肺部排出體外。這一功能的正常發(fā)揮主要取決于兩個(gè)因素：一是細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白(hemoglobin, Hb)是否具有正常的構(gòu)型并具有完善的攜氧能力；二是細(xì)胞是否有合適的雙凹形結(jié)構(gòu)，并具有較好的變形能力使之可適應(yīng)流場，便于通過包括毛細(xì)血管在內(nèi)的各種血管到達(dá)全身各個(gè)組織器官。也就是說，紅細(xì)胞的這一功能與其形態(tài)、細(xì)胞膜力學(xué)特性以及細(xì)胞內(nèi)Hb的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。

人們十分重視研究不同條件對健康人紅細(xì)胞及血紅蛋白的作用[1-4]，我們之前研究了在pH 8.0時(shí)危重病人的血紅蛋白的結(jié)構(gòu)變化[5]，但至今沒見研究報(bào)道冠心病危重病人的紅細(xì)胞力學(xué)特性及血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能情況。鑒于此，本文將探討冠心病危重病人在pH 7.4正常生理環(huán)境下紅細(xì)胞及血紅蛋白的變化，這對臨床診斷和治療具有極大意義。

材 料 和 方 法

1材料

經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并送達(dá)知情同意書情況下，分別取冠心病住院危重病人及健康成人的化驗(yàn)靜脈血6例，肝素鈉抗凝。6個(gè)病例中：(1)女，49歲，為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病、尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速，合并多發(fā)性腦梗塞；(2)女，63歲，為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病、急性前壁心肌梗死，合并肺部感染；(3)女，54歲，為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，心功能Ⅳ級，合并甲狀腺功能亢進(jìn)；(4)女，87歲，為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病、心功能Ⅲ級，合并原發(fā)性高血壓Ⅲ級；(5)女，56歲，為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病，心功能Ⅲ級，合并重癥高血壓Ⅲ級；(6)男，61歲，為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病急性ST段抬高型心肌梗死，合并肺部感染。所有這些病人取血前都沒有吸氧及均臨床診斷為危重病人須進(jìn)行有關(guān)監(jiān)護(hù)室處理。健康成人6例血樣，分別編號㊣1、㊣2、㊣3、㊣4、㊣5和㊣6作對照組。

2方法

2.1青齡、老齡紅細(xì)胞流變特性的測定

2.1.1Percoll不連續(xù)密度梯度液的制備 紅細(xì)胞的平均壽命為120 d，紅細(xì)胞在其生存期內(nèi)青齡、老齡紅細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和變形能力有所差異。紅細(xì)胞在衰老過程中，其表面積和體積會(huì)逐漸減少，但不改變胞內(nèi)血紅蛋白的量，所以隨著紅細(xì)胞老化，細(xì)胞的密度會(huì)逐漸變大。本文分離青齡、老齡紅細(xì)胞采用的方法是Percoll密度梯度分離法[6]。

① 配制SA緩沖溶液 將三蒸水與配好的HBS溶液以體積比19∶1混合好，再加入適量牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)。

② 配制SB緩沖溶液 將Percoll液與HBS溶液以體積比19:1混合好，再加入適量BSA。

③ 配制PBS-BSA溶液 pH 7.4 PBS緩沖液，加入5 mmol/L 葡萄糖，1 mmol/L MgSO4，1 g/L BSA。

④ 將上述配好的溶液SA和SB按不同比例配成密度為1 063.61～1 081.44 g/L的5個(gè)點(diǎn)并形成密度梯度。然后依次按溶液5～1的順序用移液槍向12 mL離心管沿管壁緩慢加入，這樣不連續(xù)密度梯度液制備完畢。

2.1.2青齡、老齡紅細(xì)胞的制備 取1 mL全血，放入離心機(jī)中以3 000 r/min離心3 min, 然后將血清和白膜層吸走，留下紅細(xì)胞。再加入1 mL SA溶液與紅細(xì)胞混勻，放入離心機(jī)中以3 000 r/min離心3 min，再吸走上層溶液留下紅細(xì)胞，重復(fù)3次。最后將洗凈的紅細(xì)胞與SA溶液以體積比4∶6的比例混勻，然后將混合液加入準(zhǔn)備好的梯度液中。最后放入離心機(jī)中以3 000 r/min離心20 min，上述操作均在24 ℃下完成。

健康人紅細(xì)胞可分為4個(gè)條帶，冠心病人紅細(xì)胞的4條帶界面不清，故取最上層命名為Y(青齡)，最下層命名為O(老齡)，進(jìn)行對照研究。

提取的各層紅細(xì)胞，放入細(xì)胞緩沖液中，3 000 r/min離心清洗2次，充分去除殘留的Percoll分離液，再用細(xì)胞緩沖液重懸至原來的體積。觀察紅細(xì)胞時(shí)，先將紅細(xì)胞懸液離心，取下層的紅細(xì)胞稀釋2 000倍用于紅細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，稀釋200 000倍用于變形能力的分析。上述稀釋均用PBS-BSA液。

2.1.3青齡、老齡紅細(xì)胞形態(tài)、變形能力的測定 用本實(shí)驗(yàn)室自行發(fā)展的多維顯微圖像分析技術(shù)，多維顯微圖像分析系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)如圖1所示。

將制備好的紅細(xì)胞樣品置于Nikon TE300倒置顯微鏡下，顯微鏡鹵鎢穩(wěn)流光源(100 W)光束通過孔徑大小可調(diào)的光柵后，經(jīng)聚焦透鏡照射到樣品上，其對應(yīng)孔像直徑在1 μm至200 μm范圍可調(diào)。物鏡收集的樣品透射光通過半透半反鏡后，通過顯微生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，PCO 1600高分辨率制冷型CCD(Cooke)，攝取顯微鏡觀測到的樣品圖像，再利用圖像捕捉卡和計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)圖像的顯示、存儲(chǔ)。

本文利用該技術(shù)拍攝活態(tài)紅細(xì)胞白光下的顯微圖像，拍攝選用×40物鏡，CCD的放大倍數(shù)為×20，得到的紅細(xì)胞圖像實(shí)際的放大倍數(shù)為×800。

Figure 1. Multidimensional microscopic image analysis system.

圖1多維顯微圖像分析系統(tǒng)

2.1.4紅細(xì)胞形態(tài)顯微靜態(tài)圖像分析

(1)空間定標(biāo)，通過測量標(biāo)準(zhǔn)測微尺的相關(guān)參數(shù)，求得在顯微鏡成像系統(tǒng)中所測的尺度大小和標(biāo)準(zhǔn)測微尺實(shí)際長度的比例關(guān)系。(2)拍攝具有合適對比度的紅細(xì)胞顯微圖像，見圖2，輸入顯微靜態(tài)圖像分析系統(tǒng)。(3)使用閉值分割技術(shù)并進(jìn)行二值化處理，對紅細(xì)胞邊緣進(jìn)行檢測和分割。(4)計(jì)算每個(gè)紅細(xì)胞的接觸面積、周長、長軸、短軸、形狀歸化因子等幾何參數(shù)。接觸面積、周長、長軸、短軸、形狀歸化因子等是定量反映紅細(xì)胞形態(tài)和大小的重要參數(shù)。其中形狀歸化因子(roundness facotr,REF)反映紅細(xì)胞的幾何形態(tài)，其值在0～1之間，越接近于1表示紅細(xì)胞越接近圓形，其值等于1表示紅細(xì)胞為圓形，其值小于1表示紅細(xì)胞為非圓形。

Figure 2. Static image of red blood cells.

圖2紅細(xì)胞靜態(tài)圖像

將拍攝的紅細(xì)胞形態(tài)圖像導(dǎo)入顯微靜態(tài)圖像分析軟件，按照操作步驟，利用該軟件測量分析不同條件下紅細(xì)胞形態(tài)和大小的參數(shù)。每個(gè)條件下測量分析180個(gè)紅細(xì)胞，取其平均值。

2.1.5紅細(xì)胞的顯微動(dòng)態(tài)圖像分析

(1)用倒置相差顯微鏡，通過專用圖像攝錄系統(tǒng)攝錄帶Flicker光暈的單個(gè)活態(tài)紅細(xì)胞的動(dòng)態(tài)圖像，見圖3。(2)設(shè)定亮度域值，在暈邊緣的最上、最下、最左、最右4個(gè)方向規(guī)定4個(gè)等域值點(diǎn)。(3)對動(dòng)態(tài)連續(xù)拍攝的圖像進(jìn)行自動(dòng)分析，分析程序自動(dòng)繪出2個(gè)垂直方向和2個(gè)水平方向的波動(dòng)曲線。(4)求得細(xì)胞膜的各種力學(xué)參量。其中包括紅細(xì)胞膜彎曲彈性模量Kc(表征細(xì)胞膜變形能力)。Kc值越小表明細(xì)胞膜的變形能力越好，細(xì)胞的生理特性越佳；反之，值越大表明細(xì)胞膜的變形能力越差，細(xì)胞越容易破裂。

Figure 3. The dynamic image of red blood cells.

圖3紅細(xì)胞動(dòng)態(tài)圖像

攝錄紅細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化圖像，每個(gè)錄像需要攝錄至少60幀，攝錄的畫面要保證每幅畫面僅有1個(gè)細(xì)胞，以免影響后面的分析過程。將攝錄的反映紅細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的錄像導(dǎo)入顯微動(dòng)態(tài)圖像分析軟件，按照操作步驟，測量分析單個(gè)活態(tài)紅細(xì)胞的Kc值，每個(gè)條件下測量分析180個(gè)紅細(xì)胞，取其平均值。

2.2胞內(nèi)血紅蛋白結(jié)構(gòu)的測定

2.2.1pH 7.4緩沖液的制備 分別稱取71.6 g Na2HPO4·H2O、31.21 g NaH2PO4·H2O溶解在1 000 mL的雙蒸去離子水中，分別配置20 mmol/L的 Na2HPO4和NaH2PO4溶液；調(diào)節(jié)Na2HPO4和NaH2PO4溶液的比例，配置成pH 7.4的緩沖液。緩沖液再用0.2 μm過濾器過濾，保證緩沖液無塵。

2.2.2血紅蛋白的制備 分別取各樣品全血1.5 mL，1 500 r/min離心10 min，去除上層血漿和脂質(zhì)體。紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉清洗3次，2 000 r/min離心10 min去除上清液。將洗后的紅細(xì)胞放入4 ℃冰箱預(yù)冷15 min后，加入10倍體積的冰水，劇烈搖晃使紅細(xì)胞破裂，4 ℃冰箱保存20 min，再4 ℃、12 000 r/min離心60 min，抽取上層紅細(xì)胞的溶血物，將其用0.22的一次性過濾器過濾純化，得到血紅蛋白的粗提液。粗提液再經(jīng)葡聚糖G-25過柱純化，得到純化的血紅蛋白。純化后的血紅蛋白放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

通過測量540 nm吸收光譜的吸光值得到血紅蛋白的濃度。提純后的血紅蛋白分別用之前配好的pH 7.4值的磷酸緩沖液稀釋，以100 μL血樣，加2.5 mL緩沖液[7]，制備紫外-可見光檢測樣品。

2.2.3血紅蛋白的紫外-可見光譜測定 采用熱電公司的UNICAM UV500型紫外-可見光譜儀，測量波長范圍為350～700 nm，波長精度為±0.1 nm，對各樣品檢測。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1冠心病危重病人青齡、老齡紅細(xì)胞的形態(tài)大小

由表1可知，在pH 7.4環(huán)境下冠心病危重病人的青齡、老齡紅細(xì)胞接觸面積、周長、長軸、短軸比健康人小，形狀歸化因子REF比健康人大，形態(tài)大小參數(shù)有顯著差異(P<0.01)。

表1冠心病危重病人與健康人青齡、老齡紅細(xì)胞的形態(tài)參數(shù)

GroupContactarea(μm2)Perimeter(μm)Longaxis(μm)Shortaxis(μm)REFYp39.31±3.29**22.66±1.11**7.15±0.48**6.40±0.33**0.86±0.02**Yh44.99±4.5525.01±2.158.35±0.647.01±0.470.66±0.05Op33.38±1.0220.62±0.32△△6.80±0.14△△5.52±0.18△△0.89±0.02△△Oh40.32±9.9621.97±2.087.62±0.546.43±0.560.76±0.07

REF:roundness factor.**P<0.01vsYh，△△P<0.01vsOh.

2冠心病危重病人紅細(xì)胞的彎曲彈性模量Kc

從表2可見，冠心病危重病人的紅細(xì)胞的彎曲彈性模量Kc比健康人大，二者有顯著差異(P< 0.01)。

冠心病危重病人的青齡、老齡紅細(xì)胞接觸面積、周長、長軸、短軸均比健康人小，而REF和Kc比健康人大，說明冠心病危重病人的紅細(xì)胞已從雙凹圓盤形向球形轉(zhuǎn)變，變形能力變差，這與文獻(xiàn)[8-9]結(jié)論一致。

表2冠心病危重病人與健康人青齡、老齡紅細(xì)胞彎曲彈性模量Kc

GroupKc(×10-19J)Yp2.31±0.35**Yh1.51±0.23Op3.51±0.29△△Op2.33±0.27

**P<0.01vsYh;△△P<0.01vsOh.

3pH7.4環(huán)境下血紅蛋白的紫外-可見光譜

圖4是用UV500紫外-可見光譜儀測定的在pH 7.4情況下冠心病危重病人與健康人㊣1血紅蛋白的吸收光譜，(圖中只畫出正常人㊣1的吸收光譜，其它㊣2-㊣6的吸收光譜與其一致)。415 nm是血紅素的吸收峰，542 nm和577 nm分別是氧合血紅蛋白的β和α吸收峰，它們反映氧合血紅蛋白的攜氧能力。

從圖4 可見，在pH 7.4環(huán)境下危重病人血紅素的吸收峰415 nm、氧合血紅蛋白的β吸收峰542 nm和α吸收峰577 nm，均與健康人血紅蛋白對應(yīng)的位置沒什么不同。

pH 7.4下冠心病危重病人與健康人血紅素的吸收峰415 nm、氧合血紅蛋白的β吸收峰542 nm和α吸收峰577 nm的吸光度值(A)在表3中給出。由于血紅素、氧合血紅蛋白的濃度與吸光度值呈正比，故表3提示，在pH 7.4環(huán)境下冠心病危重病人的血紅素和氧合血紅蛋白的濃度與健康人沒有顯著差異(P>0.05)。

冠心病危重病人與健康人在pH 7.4生理壞境下血紅蛋白的吸收光譜完全一致，吸收峰的位置相同且吸光度值沒有明顯差異，說明其血紅蛋白的結(jié)構(gòu)沒有改變。

Figure 4. The Hb absorption spectra of critically ill patients with coronary heart disease(①～⑥) and healthy people(㊣1).

圖4冠心病危重病人與健康人血紅蛋白的吸收光譜

表3pH7.4下冠心病危重病人與健康人血紅蛋白的吸光度值

GroupA415A542A577Hb10.7870±0.04100.0899±0.00630.0998±0.0068Hb20.7350±0.04000.0800±0.00110.0953±0.0011

討 論

紅細(xì)胞功能的發(fā)揮決定于紅細(xì)胞的幾何形狀、變形能力及其胞內(nèi)血紅蛋白的結(jié)構(gòu)功能。本研究發(fā)現(xiàn)在pH 7.4環(huán)境下冠心病危重病人的青齡、老齡紅細(xì)胞接觸面積、周長、長軸、短軸均比健康人小，形狀歸化因子REF比健康人大，說明其紅細(xì)胞的形狀已發(fā)生了變化，特別是形狀歸化因子REF提示其已從雙凹形結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為近球型。這種形態(tài)變化會(huì)影響其變形能力，所以其彎曲彈性模量Kc比健康人大，正進(jìn)一步說明了這一點(diǎn)。其原因可能是由于：(1)冠心病患者膜膽固醇含量增高及過氧化脂質(zhì)在體內(nèi)積聚，影響了紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；(2)由于體內(nèi)氧分壓相對較低，膜表面ATP濃度降低，對鈣泵的作用就會(huì)降低和消失，使細(xì)胞內(nèi)鈣潴留，影響了紅細(xì)胞變形能力；(3)由于心肌缺血后組織缺氧，造成氧自由基大量釋放及酸中毒，加重了紅細(xì)胞膜的損害，從而使紅細(xì)胞變形能力急劇下降。

但是，本研究發(fā)現(xiàn)冠心病危重病人與健康人在pH 7.4生理環(huán)境下血紅蛋白的吸收光譜基本一致，各吸收峰的位置相同且吸光度沒有明顯差異，提示冠心病人盡管其紅細(xì)胞已發(fā)生了形態(tài)變化，但仍沒有影響到胞內(nèi)，血紅蛋白的結(jié)構(gòu)基本沒有改變。由于吸收譜反映的血紅蛋白結(jié)構(gòu)信息還比較粗，冠心病危重病人血紅蛋白各級結(jié)構(gòu)更為詳盡細(xì)微的信息，還需要采用像拉曼散射譜等手段作進(jìn)一步深入的研究，以得出更加準(zhǔn)確全面的結(jié)果。

本研究揭示了冠心病危重病人的紅細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及變形能力、血紅蛋白吸收譜等參數(shù)與健康人的異同，這些工作，對心血管疾病的治療及紅細(xì)胞的病理生理研究具有指導(dǎo)作用。

[1] Gedde MM, Yang E, Huestis WH. Resolution of the paradox of red cell shape changes in low and high pH[J]. Biochim Biophys Acta, 1999, 1417(2): 246-253.

[2] Rasia M, Bollini A. Red blood cell shape as a function of medium’s ionic strength and pH[J]. Biochim Biophys Acta, 1998, 1372(2): 198-204.

[3] 姚成燦，李校坤，黃耀熊. 溫度對單個(gè)活態(tài)人紅細(xì)胞攜氧能力的即時(shí)影響[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2005,25(4):613-616.

[4] 吳正潔.酸、堿pH環(huán)境對人紅細(xì)胞和血紅蛋白的作用[D]. 廣州:暨南大學(xué), 2010.

[5] Hao X, Yue L, Lei J,et al. Effect of alkaline pH on size of hemoglobin from critically ill patient[C]∥Proceedings of 2010 First International Conference on Cellular,Molecular Biology,Biophysics and Bioengineering (CMBB),2010:452-454.

[6] Rennie CM, Thompson S, Parker AC,et al. Human erythrocyte fraction in “Percoll” density gradients[J]. Clin Chim Acta,1979, 98(1-2): 119-125.

[7] Adachi K, Asakura T. Aggregation and crystallization of hemoglobin A, S, and C.Probable formation of different nuclei for gelation and crystallization [J]. J Biol Chem, 1981, 256(4):1824-1830.

[8] 王紅勇，何作云，李?？?冠心病患者全血黏彈性的變化[J]. 中國動(dòng)脈硬化雜志,2002,10(3): 236-238.

[9] 張苗青，李溫娘.普拉固對冠心病合并高脂血癥患者血脂及血液流變學(xué)的影響[J].中國病理生理雜志，1997,13(4)：391-392.

Rheologicalpropertiesandhemoglobinstructureofredbloodcellsincri-ticallyillpatientswithcoronaryheartdisease

HAO Xi-ping1, 2, YUE Liang-yue3, LEI Jian-ming1, LI Zhou-xuan1, YANG Ji-wang1, HOU Zeng-tao1, HUANG Yao-xiong1

(1InstituteofBiomedicalEngineering,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2LuoyangKeyLaboratoryofPhotoelectricalFunctionMaterials,SchoolofPhysicsandEngineering,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China;3DepartmentofPhysics,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:tyxhuang@jnu.edu.cn)

AIM: To study the rheological properties of red blood cells (RBC) and the structure of hemoglobin in critically ill patients with coronary heart disease.METHODSAt pH 7.4, the rheological properties of RBC and the structure of hemoglobin isolated from critically ill patients with coronary heart disease and from healthy people were studied with both static and dynamic imaging techniques and ultraviolet-visible spectroscopy.RESULTSThe rheological properties of RBC from the critically ill patients with coronary heart disease were significantly different from those of healthy people. The bending modulus, which indicates the rigidity of RBC, was greater in the patients than that in healthy people. The absorption spectra of the hemoglobin of critically ill patients with coronary heart disease were almost the same as those of healthy people.CONCLUSIONThe morphology and flexibility of RBC in critically ill patients with coronary heart disease are worse than those in healthy people, whereas the structure of hemoglobin in the patients is basically found no difference from that in healthy people.

Coronary disease; Erythrocytes; Hemoglobin

Q657.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.031