H2S抑制Ang II引起的神經元活性氧水平升高的機制研究*

馬 紅， 于海云， 于 燕， 曹冬青， 黃 鶯， 金惠銘， 朱依純， 盧 寧

(復旦大學上海醫(yī)學院生理與病理生理學系，上海 徐匯 200032)

1000-4718(2012)05-0865-05

2012-01-16

2012-03-31

國家自然科學基金資助項目(No.81170237);博士點基金優(yōu)先發(fā)展領域課題(No.20110071130009)

△通訊作者 Tel：021-54237452 ；E-mail：luning7@shmu.edu.cn

H2S抑制Ang II引起的神經元活性氧水平升高的機制研究*

馬 紅， 于海云， 于 燕， 曹冬青， 黃 鶯， 金惠銘， 朱依純， 盧 寧△

(復旦大學上海醫(yī)學院生理與病理生理學系，上海 徐匯 200032)

目的探討硫化氫(H2S)對血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)所致延髓神經元活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平變化的影響，以及H2S抗氧化應激的相關機制。方法采用原代培養(yǎng)的延髓神經元，分組如下：對照組、Ang II處理組、硫氫化鈉(NaHS)處理組、NaHS+Ang II處理組和PD98059(p-ERK1/2蛋白的抑制劑)+ Ang II處理組。選用二氫乙啶(DHE)熒光探針法測定各組神經元胞內的ROS水平，Western blotting檢測ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達量，CCK-8法測定神經元的活性。結果Ang II(終濃度為100 nmol/L)引起神經元ROS水平升高；NaHS(50～200 μmol/L)明顯抑制Ang II引起的神經元ROS水平升高，但單獨給予NaHS并不影響神經元ROS水平；p-ERK1/2蛋白的抑制劑PD98059也能明顯抑制Ang II引起的神經元ROS水平的升高；適宜作用濃度的NaHS能夠顯著降低Ang II引起的神經元p-ERK1/2蛋白表達。結論H2S能夠顯著抑制Ang II引起的神經元ROS水平升高，其作用機制與MAPK家族中p-ERK1/2蛋白的表達有關。H2S可能通過降低p-ERK1/2的表達量而產生抗氧化應激作用。

硫化氫; 血管緊張素II; 神經元; 活性氧簇

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化氮(nitric oxide，NO)與一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后，逐漸被人們所公認的第3類氣體信號分子[1]，它是一種具有臭雞蛋氣味的無色小分子氣體，在體內多個系統(tǒng)中廣泛存在。近年來，大量文獻提示H2S可增加神經元的還原活性，具有抗氧化應激的功能[2-3]，最終對神經元起到保護作用。本課題組已從整體動物實驗水平上提示：H2S能夠抑制自發(fā)性高血壓大鼠中樞NADPH氧化酶的活性，引起超氧陰離子等活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平減少，繼而抑制交感興奮，產生降低血壓和心率的心血管效應[4]。在此基礎上，本工作從細胞分子水平的角度探討研究，H2S如何抵抗神經元胞內的高濃度ROS水平所致的氧化應激作用。

血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)通過增加中樞神經元胞內ROS水平，提高神經元的放電頻率，最終引起血壓升高，心率加快等整體效應[5]。Ang II主要通過激活神經元胞內的MAPK家族這條信號通路來升高ROS水平，其中主要是超氧陰離子水平，從而產生一系列重要的中樞生理調節(jié)功能[6]。因此，本次實驗選用Ang II提高神經元胞內的ROS水平，再給予外源性的H2S，觀察H2S能否抑制Ang II引起的神經元高ROS水平，以及通過何種機制起作用與何種細胞信號通路有關。

材 料 和 方 法

1主要試劑與儀器

Ang II、硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)、poly-L-lysine和二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)均購自Sigma，p-ERK1/2 抗體和ERK1/2抗體購自CST，微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)抗體與膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體購自Abcam，Neurobasal medium和B27購自Gibco，CCK-8購自上海同仁化學研究所；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱、BOXUN無菌超凈臺、AMG熒光倒置相差顯微鏡、TECAN酶標儀等。

2原代培養(yǎng)及鑒定延髓神經元

2.1原代延髓神經元的培養(yǎng) 由上海斯萊克實驗動物中心提供的孕14～16 d 的SD大鼠，取出胎鼠，在解剖顯微鏡下剪取延髓組織[7]，選用鈍頭滴管吹打收集細胞，離心條件1 500×g離心5 min，丟棄上清，加入Neurobasal medium 與B27的混合培養(yǎng)液(比例為50∶1)，配制成細胞懸液。采用0.4 %臺盼藍對神經元進行染色，測定細胞活性并計數(shù)，最后接種到35 mm的培養(yǎng)皿，3 d換1次液，每次半量換液即可，培養(yǎng)8～10 d左右，神經元已經發(fā)育成熟，即可進行以下實驗。

2.2原代延髓神經元的鑒定 將已培養(yǎng)10 d的神經元進行鑒定，具體步驟如下：(1)用0.01 mol/L PBS 洗3次；(2)4 %多聚甲醛固定細胞20 min；(3)0.01 mol/L PBS洗3次；(4) 5%～7 %動物血清封閉30 min；(5)分別加Ⅰ抗MAP-2抗體(1∶1 000)，GFAP抗體(1∶1 000)4 ℃過夜；(6)0.01 mol/L PBS洗3次；(7)加Ⅱ抗熒光工作液室溫避光2 h；(8)0.01 mol/L PBS洗3次；(9)DAPI染核5 min；(10)0.01 mol/L PBS洗3次；(11)熒光倒置相差顯微鏡下拍照鑒定。

3實驗分組處理

實驗共分4組，分別是：對照組、Ang II組、NaHS組、NaHS+Ang II組。此外在探討H2S作用的信號通路時分組如下：對照組、Ang II組、PD98059組、PD98059+Ang II組。

4神經元活性的測定

將加有藥物的培養(yǎng)液吸出，加入已混勻的含CCK-8的培養(yǎng)液，CCK-8與培養(yǎng)液的體積比例為1∶10，放置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h左右，在酶標儀上測定450 nm吸光度，再進行相應的統(tǒng)計分析。

5神經元胞內ROS水平的檢測

DHE熒光探針法檢測神經元胞內的ROS水平，主要是超氧陰離子的水平，在去除混有藥物的培液后，用D-Hanks液洗3遍，加入5 μmol/L DHE ，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，再用D-Hanks液洗3遍，最后各孔中加入等體積的D-Hanks液，用酶標儀檢測熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

6p-ERK1/2與ERK1/2蛋白表達水平的檢測

選用Western blotting 法測定。預冷的PBS洗細胞3遍，吸干后加入細胞裂解液，將刮下的蛋白移至預冷的EP管，冰上放置10 min后，沸水煮沸10 min，根據(jù)BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為35 μg，12 %SDS-聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳，濃縮膠60 V，分離膠90 V。濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h后分別加p-ERK1/2和ERK1/2多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜；TBST沖洗3次，每次10 min，加上HRP標記的兔抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，每次10 min，再進行顯影、定影。X光膠片采用Smart View生物電泳圖像分析軟件進行蛋白半定量分析處理。

7統(tǒng)計學處理

結 果

1原代培養(yǎng)神經元的鑒定

MAP-2是神經元的特異標記抗體，GFAP是神經膠質細胞的特異標記抗體，因Neurobasal medium與B27培養(yǎng)液中無血清，可以抑制神經膠質細胞的生長，故經過8～10 d的培養(yǎng)，最后存活的大都是神經元，鑒定結果見圖1：在倒置顯微鏡下拍攝可見，A圖和D圖是自然光圖；B圖是用MAP-2標記的神經元(綠色)；E圖是用GFAP標記的神經膠質細胞，幾乎見不到神經膠質細胞；C圖和F圖分別是神經元、神經膠質細胞與神經元核的熒光雙標圖片，其中藍色都是DAPI染的神經元核。

Figure 1. Primarily cultured rat medullary neurons. A,D:the phase-contrast images of neurons; B,E:immunofluorescence staining of MAP-2 and GFAP, respectively;C:combined image of B and the nuclei of neurons dyed by DAPI;F:combined image of E and the nuclei of neurons dyed by DAPI. Bar=25 μm.

圖1鑒定原代培養(yǎng)的延髓神經元

2H2S抑制AngII引起的神經元ROS水平的升高

2.1單獨給予不同濃度NaHS對神經元ROS水平的影響 單獨給予10～200 μmol/L NaHS處理神經元，DHE熒光探針檢測顯示，神經元胞內的ROS水平沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義，見圖2。

圖2不同濃度NaHS對延髓神經元ROS水平的影響

2.2H2S抑制Ang II引起的神經元ROS水平的變化 單獨給予Ang II(100 nmol/L)可明顯升高神經元的ROS水平，且該濃度Ang II對神經元的活性并沒有顯著影響，見圖3、4；50 μmol/L、100 μmol/L及200 μmol/L NaHS均可顯著抑制Ang II引起的神經元ROS水平的升高，其中100 μmol/L NaHS作用最明顯，見圖4，故以下實驗NaHS濃度均選用100 μmol/L。

圖3CCK-8檢測AngII對神經元活性的影響

圖4NaHS對AngII誘導的神經元ROS水平的影響

3H2S顯著降低AngII引起的神經元p-ERK1/2蛋白的表達

3.1Ang II引起神經元p-ERK1/2蛋白表達升高 單獨給予Ang II(100 nmol/L)引起神經元的ERK1/2蛋白發(fā)生快速磷酸化，作用出現(xiàn)在給藥后5 min、10 min、15 min和30 min，但1 h后不再改變，其中5 min磷酸化的程度最高，見圖5，故以下實驗選擇5 min作為觀察p-ERK1/2蛋白的時點。

3.2H2S降低Ang II引起的神經元p-ERK1/2蛋白表達 100 μmol/L NaHS預處理神經元30 min 后，可顯著降低Ang II(100 nmol/L)作用于神經元5 min時引起的p-ERK1/2蛋白的快速磷酸化表達，見圖6。

圖5AngII不同時間刺激引起的神經元p-ERK1/2蛋白的表達變化

圖6NaHS對AngII引起的神經元p-ERK1/2蛋白表達的影響

3.3PD98059抑制Ang II引起的神經元ROS水平的升高 PD98059是p-ERK1/2的抑制劑，結果顯示，PD98059(10 μmol/L)可顯著抑制Ang II引起的神經元ROS水平的升高，見圖7，從而進一步證實了H2S抑制Ang II引起的神經元ROS水平的升高與p-ERK1/2蛋白有關。

圖7PD98059對AngII誘導的神經元ROS水平的影響

討 論

近年來，H2S作為一種新型的氣體信號分子逐漸被人們所重視[1]。它在機體內具有許多重要的生理保護功能，如生理濃度的H2S可以減緩急性心肌梗死所造成的心肌缺血再灌注損傷；對糖尿病腎病也有一定的保護作用；在中樞神經系統(tǒng)中，適宜濃度的H2S可通過提高神經元胞內的谷氨酰胺水平等機制來抵抗氧化應激所造成的損傷[2-3,8-9]。

眾所周知，內源性H2S主要由2種5’-磷酸吡哆醛依賴酶胱硫醚 β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)、胱硫醚 γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)和一種非磷酸吡哆醛依賴酶 3-巰基丙酮酸轉硫酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MPST)催化生成[10]，中樞神經系統(tǒng)中的H2S主要由CBS催化生成[11]。本實驗中，我們選擇NaHS作為H2S的供體，NaHS在機體內可解離成Na+和HS-，HS-與體液中的H+結合生成H2S，故NaHS和H2S在機體內形成動態(tài)平衡。因NaHS可以保證培養(yǎng)液中H2S濃度的相對穩(wěn)定，所以目前為止多數(shù)文獻都選用NaHS作為外源性H2S的供體。

延髓是機體中重要的心血管調節(jié)中樞，本課題組的整體實驗結果顯示：H2S通過降低自發(fā)性高血壓大鼠延髓腹外側區(qū)的ROS水平而產生降低血壓與心率的心血管效應[4]，那么H2S是如何降低延髓神經元ROS水平的呢？因此本次實驗就選擇原代培養(yǎng)的延髓神經元作為研究對象，給予一定濃度的Ang II，造成神經元胞內的ROS水平一定程度的升高，再給予外源性的NaHS，觀察H2S通過何種機制及信號通路來抑制Ang II引起的神經元ROS水平的升高，從而保護神經元免受氧化應激等毒副作用。

H2S本身就是一種還原性的氣體信號分子，具有一定的抗氧化應激的作用，在維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要的作用。單獨給予神經元一定濃度范圍的NaHS，神經元的ROS水平沒有明顯變化，說明了H2S對神經元有一定程度的適應性保護作用。本研究結果顯示：H2S與p-ERK1/2蛋白的抑制劑PD98059都能顯著抑制Ang II引起的神經元ROS水平的升高；在細胞分子水平上，100 μmol/L NaHS能夠顯著抑制Ang II引起的神經元p-ERK1/2蛋白的快速磷酸化作用。

ROS是指化學性質比較活躍的含氧原子或原子團，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等等，內源性ROS的來源主要包括NADPH氧化酶、過氧化物酶、細胞色素P450、黃嘌呤氧化酶、γ-谷氨酰轉肽酶等，而神經元胞內的ROS主要由NADPH氧化酶催化生成[12]。NADPH氧化酶主要由3個胞漿亞單位(p40phox、p47phox、p67phox)和2個胞膜亞單位(gp91phox、p22phox)組成。據(jù)文獻報道，Ang II升高神經元胞內的ROS水平與NADPH氧化酶的p47phox亞單位及gp91phox亞單位激活有關[6, 13]，且H2S可以通過降低NADPH氧化酶的gp91phox亞單位的表達來減少ROS生成，從而抵抗氧化應激[14]。在本實驗中，H2S抑制Ang II引起的神經元ROS水平的升高究竟與NADPH氧化酶的何種亞單位有關，它(們)與p-ERK1/2又是怎樣的上下游關系，這正是我們未來研究的重點。

綜上所述，H2S能夠顯著抑制Ang II引起的神經元ROS水平的升高，其作用機制與MAPK家族中p-ERK1/2蛋白表達有關，H2S通過降低p-ERK1/2的表達量而產生抗氧化應激的作用。

[1] Wang R. Two’s company, three’s a crowd: can H2S be the third endogenous gaseous transmitter?[J]. FASEB J,2002,16(13):1792-1798.

[2] Kimura Y, Kimura H. Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress[J]. FASEB J,2004,18(10):1165-1167.

[3] Umemura K, Kimura H. Hydrogen sulfide enhances reducing activity in neurons: neurotrophic role of H2S in the brain?[J]. Antioxid Redox Signal, 2007,9(11):2035-2041.

[4] 于海云，馬 紅，曹銀祥，等.硫化氫對SHR大鼠的中樞心血管效應及其機制探討[J].中國分子心臟病學雜志，2011，11(4)：235-240.

[5] Sun C, Sellers KW, Sumners C, et al. NAD(P)H oxidase inhibition attenuates neuronal chronotropic actions of angiotensin II[J]. Circ Res,2005,96(6): 659-666.

[6] Chan SH, Hsu KS, Huang CC, et al. NADPH oxidase-derived superoxide anion mediates angiotensin II-induced pressor effect via activation of p38 mitogen-activated protein kinase in the rostral ventrolateral medulla[J]. Circ Res, 2005,97(8):772-780.

[7] Brailoiu GC, Brailoiu E, Parkesh R, et al. NAADP-mediated channel ‘chatter’ in neurons of the rat medulla oblongata[J]. Biochem J, 2009,419(1):91-97.

[8] Elrod JW, Calvert JW, Morrison J, et al. Hydrogen sulfide attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by preservation of mitochondrial function[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007,104(39):15560-15565.

[9] Gao Y, Yao X, Zhang Y, et al. The protective role of hydrogen sulfide in myocardial ischemia-reperfusion-induced injury in diabetic rats[J]. Int J Cardiol, 2011,152(2):177-183.

[10]Shibuya N, Tanaka M, Yoshida M, et al. 3-Mercaptopyruvate sulfurtransferase produces hydrogen sulfide and bound sulfane sulfur in the brain[J]. Antioxid Redox Signal, 2009,11(4):703-714.

[11]Chen X, Jhee KH, Kruger WD. Production of the neuromodulator H2S by cystathionine β-synthase via the condensation of cysteine and homocysteine[J]. J Biol Chem,2004,279(50):52082-52086.

[12]Bedard K, Krause KH. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology[J]. Physiol Rev,2007,87(1):245-313.

[13]Oliveira-Sales EB, Nishi EE, Carillo BA, et al. Oxidative stress in the sympathetic premotor neurons contributes to sympathetic activation in renovascular hypertension[J]. Am J Hypertens,2009, 22(5):484-492.

[14]Muzaffar S, Jeremy JY, Sparatore A, et al. H2S-donating sildenafil (ACS6) inhibits superoxide formation and gp91phox expression in arterial endothelial cells:role of protein kinases A and G[J]. Br J Pharmacol,2008,155(7): 984-994.

HydrogensulfidesuppressestheincreaseinreactiveoxygenspeciesinneuronsinducedbyangiotensinIIviaERK1/2signalpathway

MA Hong, YU Hai-yun, YU Yan, CAO Dong-qing, HUANG Ying, JIN Hui-ming, ZHU Yi-chun, LU Ning

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,FudanUniversityShanghaiMedicalCollege,Shanghai200032,China.E-mail:luning7@shmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of hydrogen sulfide (H2S) on the reactive oxygen species (ROS) level in medullary neurons induced by angiotensin II (Ang II).METHODSPrimarily cultured rat medullary neurons were divided into 5 groups as follows: control group, Ang II group, sodium hydrosulfide(NaHS) group, NaHS with Ang II group, and PD98059 (an inhibitor of p-ERK1/2) with Ang II group. ROS production was measured with dihydroethidium (DHE) staining. The expression of p-ERK1/2 and ERK1/2 was determined by Western blotting. The activity of neurons was detected by CCK-8 assay.RESULTSAng II at concentration of 100 nmol/L significantly increased ROS level in the neurons, but the effect was inhibited by NaHS at concentrations of 50～200 μmol/L, while NaHS alone had no influence on the ROS level in neurons. Additionally, PD98059 also depressed the ROS level in neurons induced by Ang II. Furthermore, the enhanced expression of p-ERK1/2 in the neurons induced by Ang II was significantly reduced by NaHS.CONCLUSIONH2S remarkably inhibits the ROS level in the neurons induced by Ang II via activation of MAPK signal pathways, especially p-ERK1/2, indicating that H2S rescues neurons from oxidative stress through declining the enhanced expression of p-ERK1/2.

Hydrogen sulfide; Angiotension II; Neurons; Reactive oxygen species

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.017