涼血活血膠囊對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損的干預(yù)作用*

底婷婷， 趙京霞, 王 燕， 劉 欣， 梁代英， 李 萍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院, 北京市中醫(yī)研究所病理生理室，北京 100010)

1000-4718(2012)04-0718-05

2011-08-29

2012-01-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81072810)

△通訊作者 Tel：010-52176679 ；E-mail：liping411@yahoo.com.cn

·短篇論著·

涼血活血膠囊對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損的干預(yù)作用*

底婷婷， 趙京霞, 王 燕， 劉 欣， 梁代英， 李 萍△

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院, 北京市中醫(yī)研究所病理生理室，北京 100010)

目的觀察涼血活血膠囊對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型中免疫異常的干預(yù)作用。方法BALB/c雌性小鼠48只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，涼血活血膠囊高、中、低劑量組和雷公藤多苷組。采用銀屑病皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)觀察銀屑病樣小鼠模型皮損變化情況。光鏡下觀察皮損組織形態(tài)學(xué)變化，測(cè)量表皮層厚度。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)皮損中增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)反映表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖程度；檢測(cè)CD3、CD11c、F4/80和Gr-1反映炎癥浸潤(rùn)程度；檢測(cè)CD31以反映血管增生情況。結(jié)果模型組小鼠皮膚出現(xiàn)鱗屑紅斑，皮損增厚；皮損組織表現(xiàn)為表皮棘層增厚，角化不全和微膿腫；真皮大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管增生明顯。與模型組比較，涼血活血膠囊組小鼠銀屑病樣皮損癥狀緩解，PASI分?jǐn)?shù)降低，表皮角化不全減輕，角質(zhì)形成增殖減少，T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)減弱，新生血管減少。結(jié)論涼血活血膠囊可通過(guò)影響表皮細(xì)胞過(guò)度增殖、角化不全、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及血管增生而改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損變化。

銀屑??； 咪喹莫特； 涼血活血膠囊

銀屑病是一種常見(jiàn)的炎性增殖性皮膚疾病，屬于自身免疫性疾病。咪喹莫特(imiquimod，IMQ)為免疫激活劑，可通過(guò)激發(fā)Toll樣受體致免疫激活，誘發(fā)小鼠皮膚類似銀屑病樣的皮損改變[1]。清熱解毒、涼血活血是中醫(yī)治療血熱證銀屑

病的基本法則，涼血活血膠囊則由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院臨床有效經(jīng)驗(yàn)方制成，療效肯定[2]。本實(shí)驗(yàn)在咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠皮膚銀屑病樣皮損模型的基礎(chǔ)上，觀察涼血活血膠囊的免疫干預(yù)作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

BALB/c雌性小鼠48只[由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(京)20090007]，體重18～20 g。

2試劑和藥物

涼血活血膠囊(北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室)；咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品)；雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥有限公司產(chǎn)品)；凡士林(河北蘭煉飛天石化有限公司產(chǎn)品)；兔和鼠二步法檢測(cè)試劑盒、3%H2O2去離子水、DAB顯色液(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體、CD3單克隆抗體、CD11c單克隆抗體(Abcam)；CD31單克隆抗體、Gr-1單克隆抗體(BD)；F4/80單克隆抗體(Biolegend)；Vectastain ABC KitⅡ抗、 NovaRED顯色液(Vector Laboratories)。

3造模制備及分組

參考Leslie等模型制備方法。實(shí)驗(yàn)前48只BALB/c雌性小鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(80 mg/kg)，背部去毛后單籠飼養(yǎng)。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(normal)，模型組(model)，涼血活血膠囊(Liang Xue Huo Xue capsules，LXHX)高、中、低劑量組和雷公藤多苷(glycosides ofTripterygiumwilfordii，GTW)陽(yáng)性藥物對(duì)照組。各組小鼠(除正常對(duì)照組小鼠涂抹適量凡士林)背部每日涂抹4%咪喹莫特乳膏42 mg，同時(shí)灌胃給藥，每天1次，每次4 mL，連續(xù)8 d：正常對(duì)照組與模型組給予生理鹽水；涼血活血膠囊高、中、低劑量組分別給予涼血活血膠囊溶液2 mg/kg、1 mg/kg、0.5 mg/kg；雷公藤多苷組給予10 mg/kg雷公藤多苷片溶液。

4檢測(cè)指標(biāo)與方法

4.1各組小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)分 依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)給予小鼠相應(yīng)紅斑、鱗屑及浸潤(rùn)增厚程度的積分，將三者積分相加得到總積分，觀察小鼠皮損的變化情況。

4.2各組小鼠皮損病理改變 采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察。剪取各組小鼠裸露皮膚，經(jīng)HE染色觀察皮膚組織學(xué)改變，并測(cè)量表皮厚度以反應(yīng)表皮增厚情況。

4.3各組小鼠皮損PCNA、CD3、CD11c、F4/80、Gr-1及CD31的表達(dá)

4.3.1各組小鼠皮膚中PCNA和CD3的表達(dá) 石蠟切片經(jīng)抗原熱修復(fù)、抗體孵育、DAB顯色，蘇木精復(fù)染。同步設(shè)立陰性對(duì)照。

4.3.2各組小鼠皮膚中CD11c、F4/80、Gr-1和CD31的表達(dá) 小鼠皮損經(jīng)OCT包埋做冰凍切片，冰丙酮固定、抗體孵育、NovaRED顯色，蘇木精復(fù)染。同步設(shè)立陰性對(duì)照。切片采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，各指標(biāo)以累積吸光度(IA)總和吸光度值(A)表示。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1各組小鼠皮損部紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)增厚及皮損積分的變化

圖1可見(jiàn),與對(duì)照組相比，IMQ涂抹1 d后模型組皮膚即出現(xiàn)紅斑；2～3 d出現(xiàn)鱗屑，7～8 d最嚴(yán)重；皮膚持續(xù)增厚，類似銀屑病樣皮損。隨著藥物作用積蓄，模型組皮損日益嚴(yán)重，紅斑由淡粉色斑點(diǎn)變?yōu)榇竺娣e深紅色斑塊、鱗屑增多增厚、皮膚增厚浸潤(rùn)明顯。雷公藤多苷組、涼血活血膠囊高、中、低劑量組皮損與模型組相比皮損癥狀明顯減輕，皮膚較光滑，鱗屑稀少，紅斑色淺，浸潤(rùn)增厚較輕，見(jiàn)圖2。

Figure 1. Scores of mouse skin lesions induced by IMQ. Erythema (A), scaling (B), and thickness (C) were scored daily. Additionally, the cumulative scores (D) were calculated.

圖1各組小鼠皮損積分趨勢(shì)

Figure 2. Gross observation of mice at day 8 of treatment. A: normal group, skin was smooth, rosy and thin; B: model group, hypertrophic lesions with heavy scales over, skin lesion was dark red; C: LXHX group, scattered scales, skin lesion was not so thick as model group, the color was less red; D: GTW group, less scales, skin lesions was significantly thinner than model, the color was less red.

圖2各組小鼠治療8d皮損大體表現(xiàn)

2涼血活血膠囊對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損動(dòng)物模型組織學(xué)變化的影響

HE染色顯示：治療8 d后，對(duì)照組皮膚表皮層菲薄，僅2～3層。模型組表皮突延長(zhǎng)，角化不全，表皮棘細(xì)胞層增厚，基底細(xì)胞核分裂像較多，可見(jiàn)Munro微膿腫，類似銀屑病樣的皮損形成。涼血活血膠囊組皮損中表皮層較平整，角化不全的細(xì)胞明顯減少，表皮層厚度明顯低于模型組。作用結(jié)果與雷公藤多苷組相似，見(jiàn)圖3。通過(guò)測(cè)量表皮層的垂直厚度發(fā)現(xiàn)：模型組表皮層增厚明顯，約為正常對(duì)照組小鼠表皮厚度的9～10倍，涼血活血膠囊組表皮增厚程度低，與模型組比較有顯著差異(P<0.01)，其中中劑量組抑制表皮增厚效果最為明顯，見(jiàn)表1。

Figure 3. Histological changes of skin lesions of mice at day 8 of treatment (HE staining, ×200). A: normal group; B: model group; C: LXHX-M group; D: GTW group. ☆ indicates Munro microabscesses and △indicates parakeratosis.

圖3各組小鼠治療8d皮損組織學(xué)改變

表1各組治療8d小鼠皮損表皮層厚度比較

GroupEpidermisthicknessNormal8.83±2.25**Model81.49±12.78LXHX-H56.77±11.66**LXHX-M48.10±13.59**LXHX-L49.84±5.80**GTW48.11±13.57**

**P<0.01vsmodel.

3涼血活血膠囊對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損PCNA表達(dá)的影響

正常小鼠皮膚僅基底層細(xì)胞增殖明顯，PCNA顯色呈線狀排列；模型組表皮著色細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量明顯增多，涼血活血膠囊組與雷公藤多苷組相似，著色細(xì)胞層數(shù)較模型組少，見(jiàn)圖4。圖像分析結(jié)果顯示，涼血活血膠囊組PCNA的表達(dá)與模型組顯著差異(P<0.01)，見(jiàn)表2。

4涼血活血膠囊對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

(1)模型組小鼠較對(duì)照組真皮層褐色沉淀顆粒(CD3、CD11c)明顯增多，涼血活血膠囊組表達(dá)量顯著低于模型組，其中中劑量組最為明顯。雷公藤多苷組與涼血活血膠囊組結(jié)果相似，見(jiàn)圖5。(2)與對(duì)照組相比，模型組的紅色沉淀顆粒(F4/80、Gr-1)明顯增多，而涼血活血膠囊組及雷公藤多苷組表達(dá)量要明顯少于模型組，見(jiàn)圖5。經(jīng)圖像分析結(jié)果表明，涼血活血膠囊組各檢測(cè)指標(biāo)表達(dá)量分別與模型組具有顯著差異(P<0.01)，見(jiàn)表2。

Figure 4. PCNA expression of skin lesions at day 8 of treatment (immunohistochemical staining, ×200). A: normal group; B: model group; C: LXHX-M group; D: GTW group. Arrow indicates PCNA positive expression.

圖4各組小鼠治療8d皮損PCNA表達(dá)

Figure 5. The expression of CD3,CD11c,F4/80 and Gr-1 in skin lesions at day 8 of treatment (immunohistochemical staining,×200). A: normal group; B: model group; C: LXHX-M group; D: GTW group. Arrows indicate positive expression.

圖5各組小鼠治療8d皮損CD3、CD11c、F4/80及Gr-1的表達(dá)

5涼血活血膠囊對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的影響

與對(duì)照組相比，模型組皮損真皮中紅色沉淀顆粒(CD31)明顯增多，涼血活血膠囊組與雷公藤多苷組皮損沉淀少，見(jiàn)圖6。圖像分析結(jié)果表明，涼血活血膠囊組中CD31表達(dá)與模型組比較有顯著差異(P<0.01)，見(jiàn)表2。

Figure 6. CD3 expression in skin lesions at day 8 treatment (immunohistochemical staining, ×200). A: normal group; B: model group; C: LXHX-M group; D: GTW group. Arrows indicate positive expression.

圖6各組治療8d小鼠皮損CD31表達(dá)

表2 各組小鼠治療8 d皮損PCNA、CD3、CD11c、F4/80、CD31及Gr-1的表達(dá)

**P<0.01vsmodel.

討 論

銀屑病為常見(jiàn)的以鱗屑性紅斑為臨床特點(diǎn)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)定義其為免疫介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病[3]。雖然銀屑病以表皮過(guò)度增殖為特征，但T淋巴細(xì)胞異?；罨徒?rùn)才是其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)[4]?；罨疶細(xì)胞可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖，并促釋放細(xì)胞因子，進(jìn)而增加強(qiáng)T細(xì)胞活性狀態(tài)，同時(shí)細(xì)胞因子還影響表皮增生及凋亡調(diào)控基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致銀屑病皮損表現(xiàn)。

咪喹莫特是Toll樣受體激動(dòng)劑，主要通過(guò)活化先天性免疫系統(tǒng)和誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞免疫，刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答[5]，在治療合并有銀屑病的光化性角化病和皮膚基底細(xì)胞癌時(shí)，可加重原以得到良好控制的銀屑病癥狀。Leslie等將咪喹莫特外用于小鼠皮膚造成銀屑病樣的皮損變化[1]，我們也證實(shí)了咪喹莫特可誘導(dǎo)制備銀屑病樣皮損模型：模型鼠皮膚在涂藥后第2 d即出現(xiàn)淡紅色斑點(diǎn)及少量細(xì)屑。隨著藥物作用，紅斑色深增大，6 d達(dá)高峰，持續(xù)至8 d后緩慢消退(數(shù)據(jù)未顯示)；鱗屑變厚成層，8 d幾乎覆蓋全部暴露皮膚。皮損在4 d左右增厚明顯，8 d達(dá)高峰。故本實(shí)驗(yàn)選擇8 d作為療效觀察點(diǎn)，研究涼血活血膠囊的作用環(huán)節(jié)。

銀屑病主要病理特征為表皮增殖活躍、角化不全、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管增生等。檢測(cè)PCNA反映細(xì)胞增殖程度，CD3、CD11c、F4/80、Gr-1分別是T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的標(biāo)志物，可反映炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，CD31主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面，可反映血管增殖變化。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用涼血活血膠囊治療咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮損，皮膚癥狀得以明顯緩解，PASI積分顯著降低；組織形態(tài)變化趨于正常，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖減緩，角化不全的細(xì)胞減少；炎癥浸潤(rùn)程度降低；新生血管數(shù)量減少。因此研究提示涼血活血膠囊有明顯的抗炎作用，可能通過(guò)抑制樹(shù)突細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的激活，減輕皮損表皮和血管的變化，從而改善病理改變。此項(xiàng)研究為臨床使用涼血活血膠囊治療銀屑病提供理論依據(jù)，而在治療銀屑病過(guò)程中涼血活血膠囊干預(yù)作用的靶點(diǎn)及通路則是我們今后繼續(xù)研究的方向及重點(diǎn)。

[1] van der Fits L, Mourits S, Voerman JS, et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis [J]. J Immunol, 2009, 182(9): 5836-5845.

[2] 孫麗蘊(yùn), 陳 凱, 鄧丙戌, 等. 涼血活血膠囊治療血熱型銀屑病的臨床研究 [J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志, 2002, 1(1):16-18.

[3] Gaspari AA. Innate and adaptive immunity and the pathophysiology of psoriasis [J]. J Am Acad Dermatol, 2006, 54(3 Suppl 2):S67-S80.

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[5] Valins W, Amini S, Berman B. The expression of Toll-like receptors in dermatological diseases and the therapeutic effect of current and newer topical Toll-like receptor modulators [J]. J Clin Aesthet Dermatol, 2010, 3(9):20-29.

EffectofLiangXueHuoXuecapsulesonmousepsoriasis-likelesionsinducedbyimiquimod

DI Ting-ting, ZHAO Jing-xia, WANG Yan, LIU Xin, LIANG Dai-ying, LI Ping

(DepartmentofPathophysiology,BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China.E-mail:liping411@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the effects of Liang Xue Huo Xue (LXHX) capsules on mouse psoriasis-like lesions induced by imiquimod (IMQ).METHODSBALB/c female mice (n=48) were randomly divided into 6 groups: normal group, model group, LXHX capsules groups with high, medium or low doses, and glycosides ofTripterygiumwilfordii(GTW) group. On day 8, skin lesions were determined by pathological examination. The lesions were evaluated according to the psoriasis area and severity index (PASI). The histology and epidermal thicknesses were observed under light microscope. The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was detected by immunohistochemical staining. Meanwhile, the positive expression of CD3, CD11c, F4/80, CD31 and Gr-1 was counted by immunohistochemical staining.RESULTSCompared with model group, the cutaneous symptoms in LXHX capsules groups were alleviated, with PASI scores decreased, epidermal parakeratosis and epidermal over-proliferation relived, the numbers of dermal T lymphocytes, dendritic cells, macrophages, neutrophils and monocytes reduced significantly.CONCLUSIONLXHX capsules improve imiquimod-induced mouse psoriasis-like lesions by inhibiting over-proliferation of keratinocytes, parakeratosis, inflammatory infiltration and angiogenisis.

Psoriasis; Imiquimod; Liang Xue Huo Xue capsules

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.024