乙型肝炎病毒X蛋白通過(guò)降低P4啟動(dòng)子甲基化水平上調(diào)人IGF-II基因的轉(zhuǎn)錄*

湯紹輝， 張良鵬， 吳小娟， 張嫚嫚， 王曠靖， 周鴻科， 羅羽宏， 曹明溶△

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1消化科,2普通外科，廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)09-1633-06

2012-03-22

2012-05-11

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.9151008901000001)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目(No.A2009367)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(No.11610407)

△通訊作者 Tel：020-38688039； E-mail：xiger66666@163.com

乙型肝炎病毒X蛋白通過(guò)降低P4啟動(dòng)子甲基化水平上調(diào)人IGF-II基因的轉(zhuǎn)錄*

湯紹輝1， 張良鵬1， 吳小娟1， 張嫚嫚1， 王曠靖1， 周鴻科1， 羅羽宏2， 曹明溶2△

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院1消化科,2普通外科，廣東 廣州 510632)

目的構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌細(xì)胞株HepG2-HBx，探討HBx對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子 II(IGF-II)基因P4啟動(dòng)子甲基化水平及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。方法應(yīng)用基因重組技術(shù)，構(gòu)建含HBx基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro-HBx，采用磷酸鈣共沉淀法將其轉(zhuǎn)染293FT包裝細(xì)胞產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染HepG2肝癌細(xì)胞，采用嘌呤霉素進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，Western blotting鑒定表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞株HepG2-HBx。采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)HepG2-HBx細(xì)胞中P4啟動(dòng)子甲基化水平及P4 mRNA表達(dá)水平變化。進(jìn)一步將體外甲基化的人IGF-II基因P4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告載體pGL3-P4及含HBx基因的pCMV-tag2B-X質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞，采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法及雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pGL3-P4載體上P4啟動(dòng)子甲基化水平及轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性變化。結(jié)果(1)經(jīng)Western blotting鑒定，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞株HepG2-HBx；(2)表達(dá)HBx蛋白的HepG2-HBx細(xì)胞中P4啟動(dòng)子甲基化CpG位點(diǎn)的比例(9.0%)明顯低于對(duì)照細(xì)胞HepG2-control(25.0%)(P<0.01)，而其P4 mRNA表達(dá)水平則為對(duì)照細(xì)胞HepG2-control的2.8倍；(3)共轉(zhuǎn)染pCMV-tag2B-X質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中pGL3-P4載體上P4啟動(dòng)子甲基化CpG位點(diǎn)的比例(60.8%)明顯低于共轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pCMV-tag2B的HepG2細(xì)胞(84.1%)(P<0.01)，而前者P4啟動(dòng)子相對(duì)螢光素酶活性(14.12±0.89)則明顯高于后者(4.61±0.76)(P<0.01)。結(jié)論HBx蛋白可降低IGF-II基因P4啟動(dòng)子甲基化水平，進(jìn)而上調(diào)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

乙型肝炎病毒X蛋白; 胰島素樣生長(zhǎng)因子II； 啟動(dòng)子； DNA甲基化

人胰島素樣生長(zhǎng)因子II(insulin-like growth factor II，IGF-II)是一種由67個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其基因含9個(gè)外顯子和4個(gè)啟動(dòng)子(P1～P4)。近年我們與其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，由于P3和P4啟動(dòng)子再激活而導(dǎo)致的IGF-II基因過(guò)表達(dá)與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。P4啟動(dòng)子再激活的機(jī)制可能涉及幾個(gè)方面，其中，我們前期的研究顯示肝癌組織中P4啟動(dòng)子低甲基化可能是其再激活而致IGF-II大量表達(dá)的機(jī)制之一[3]。但是，引起P4啟動(dòng)子低甲基化的原因及機(jī)制尚不明確。

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)在肝細(xì)胞癌的發(fā)生中具有重要作用[4]，但其致癌機(jī)制尚未完全明確。在我國(guó)，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是肝細(xì)胞癌的主要病因，而我們前期的研究顯示絕大多數(shù)肝癌組織IGF-II基因P4啟動(dòng)子甲基化水平明顯降低[3]，此現(xiàn)象是否提示HBx蛋白表達(dá)與P4啟動(dòng)子低甲基化存在相關(guān)性？目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。鑒于此，本研究擬探討HBx蛋白對(duì)IGF-II基因P4啟動(dòng)子甲基化水平及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響，為闡明肝癌發(fā)生中P4啟動(dòng)子低甲基化的原因及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

PrimeSTAR HS DNA聚合酶為TaKaRa產(chǎn)品，抗HBx抗體為Abcam產(chǎn)品，Trizol 試劑為Invitrogen產(chǎn)品，雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)為Promega產(chǎn)品，pBABE-puro逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為Addgene產(chǎn)品，pCMV-tag2B-X質(zhì)粒(含HBx基因)及對(duì)照質(zhì)粒pCMV-tag2B由廣州南方醫(yī)科大學(xué)肝病中心梁敏鋒博士惠贈(zèng)，人IGF-II基因P4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)告載體pGL3-P4(含P4啟動(dòng)子-1 129～+117片段)為本研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建，HepG2肝癌細(xì)胞株購(gòu)買于ATCC，293FT細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen。

2方法

2.1穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞株HepG2-HBx構(gòu)建

2.1.1含HBx基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro-HBx構(gòu)建 根據(jù)pCMV-tag2B-X質(zhì)粒上HBx基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HBx基因，上游引物5’-CCG CTC GAG ATG GCT GCT AGG CTG TGC TG-3’(含XhoI位點(diǎn))，下游引物5’-CG GAA TTC TTA GGC AGA GGT GAA AAA GTT G-3’(含EcoR I位點(diǎn))，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度465 bp。將HBx基因的PCR產(chǎn)物純化，純化后的產(chǎn)物及pBABE-puro載體分別經(jīng)XhoI和EcoR I雙酶切，T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用菌落PCR及雙酶切鑒定后送上海英駿生物公司測(cè)序分析。

2.1.2磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293FT包裝細(xì)胞產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒 將293FT包裝細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過(guò)夜。將20 μg PIK包裝質(zhì)粒分別與20 μg pBABE-puro-HBx載體及對(duì)照載體pBABE-puro混合，再依次加入適量CaCl2、H2O及HBS溶液，混勻，加入待轉(zhuǎn)染的293FT細(xì)胞中，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育5 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。收集含病毒的上清液，過(guò)濾，分裝置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3病毒上清液感染HepG2肝癌細(xì)胞及陽(yáng)性克隆篩選 將含聚凝胺(4 mg/L)的病毒上清液加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2肝癌細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)3 h，吸棄培養(yǎng)基，換新病毒上清液，如此重復(fù)感染3次，完畢后換正常培養(yǎng)基。感染結(jié)束后48 h加入嘌呤霉素(0.5 mg/L)篩選陽(yáng)性克隆(包括含pBABE-puro-HBx載體及對(duì)照載體pBABE-puro的HepG2細(xì)胞克隆)。

2.1.4Western blotting鑒定表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞株HepG2-HBx 制備HepG2-HBx肝癌細(xì)胞及對(duì)照肝癌細(xì)胞HepG2-control(含對(duì)照載體pBABE-puro)總蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉封閉。加入稀釋的Ⅰ抗(抗HBx及抗β-actin)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠Ⅱ抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)攝像及分析結(jié)果。

2.2表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞HepG2-HBx及對(duì)照肝癌細(xì)胞HepG2-control中P4啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及P4 mRNA表達(dá)水平分析

2.2.1亞硫酸氫鹽測(cè)序 制備HepG2-HBx細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞HepG2-control基因組DNA，取2 μg DNA，按CpGenomeTMDNA Modification 試劑盒(BioLabs產(chǎn)品)說(shuō)明進(jìn)行DNA修飾，純化回收修飾后的DNA用于PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物根據(jù)P4啟動(dòng)子序列(GenBank進(jìn)入號(hào)NT_009308)設(shè)計(jì)，上游引物5’-GTA GAA GTT TAT TTT GGT ATG TTG A-3’，下游引物5’-AAT CTC CTT CCC ACC TCC TTA TAT A-3’，片段長(zhǎng)度307 bp，擴(kuò)增區(qū)-555～-248。PCR產(chǎn)物亞克隆入pMD19-T載體，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析，共測(cè)序8個(gè)克隆。

2.2.2實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 根據(jù)文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)IGF-II基因P4啟動(dòng)子特異的轉(zhuǎn)錄子(以下簡(jiǎn)稱P4轉(zhuǎn)錄子)，上游引物5’-TCT CCT GTG AAA GAG ACT TCC AG-3’，下游引物5’- CAA GAA GGT GAG AAG CAC CAG -3’，片段長(zhǎng)度137 bp。以β-actin為對(duì)照。采用Trizol試劑制備HepG2-HBx細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞HepG2-control總RNA，用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增與檢測(cè)IGF-II基因P4 mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每個(gè)樣本同時(shí)擴(kuò)增3復(fù)管，并連續(xù)進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)。采用相對(duì)定量法(2-ΔΔCt)表示目的基因表達(dá)量。

2.3雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)及亞硫酸氫鹽測(cè)序檢測(cè)HBx蛋白對(duì)P4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響

2.3.1pGL3-P4載體體外甲基化、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及瞬時(shí)表達(dá) 將pGL3-P4載體在體外用SssI CpG甲基轉(zhuǎn)移酶(BioLabs產(chǎn)品) 孵育，然后將純化后的反應(yīng)產(chǎn)物用HpaⅡ內(nèi)切酶消化，以證實(shí)完全甲基化。將完全甲基化pGL3-P4載體與pCMV-tag2B-X或其對(duì)照空質(zhì)粒pCMV-tag2B用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞。操作完畢，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每個(gè)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)同時(shí)做3復(fù)孔，并連續(xù)進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)。

2.3.2雙螢光素酶實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后，制備上述細(xì)胞裂解物，按雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞裂解物的熒光素酶活性。

2.3.3亞硫酸氫鹽測(cè)序 轉(zhuǎn)染48 h后，制備上述細(xì)胞基因組DNA，取2μg DNA，按CpGenomeTMDNA Modification 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA修飾，純化回收修飾后的DNA用于巢式PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物根據(jù)pGL3-Basic載體(GenBank進(jìn)入號(hào)U47295.2)及P4啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)，上、下游外側(cè)引物分別為5’-AAT AGG TTG TTT TTA GTG TAA GTG-3’及5’-TCC TCC CCC CCA AAC TCA AC-3’；上、下游內(nèi)側(cè)引物分別為5’-AGT GTA AGT G TA GGT GTT AG-3’及5’-CAC ACC ACT TAC CTA AAA AC-3’，片段長(zhǎng)度241 bp，擴(kuò)增區(qū)為pGL3-P4載體上P4啟動(dòng)子-1 129～-926片段。PCR產(chǎn)物亞克隆入pMD19-T載體，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析，共測(cè)序8個(gè)克隆。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro-HBx的構(gòu)建鑒定

以pCMV-tag2B-X載體為模板，擴(kuò)增出HBx基因，克隆入pBABE-puro載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后抽提重組質(zhì)粒，經(jīng)XhoI和EcoR I雙酶切得到1條約465 bp的HBx目的片段及載體大片段，見(jiàn)圖1A、B。目的片段測(cè)序分析結(jié)果與GenBank中AF223955.1HBx基因相符。

Figure 1. Construction and identification of HepG2-HBx cell lines expressing hepatitis B virus X protein (HBx). A: electrophoresis analysis of PCR product forHBxgene;B:electrophoresis analysis of dual enzyme digestion of pBABE-puro-HBx recombinant retroviral vector;C: Western blot analysis of HBx protein expression in HepG2-HBx cell line.M:DL2000 DNA marker.

圖1表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞株HepG2-HBx的構(gòu)建與鑒定

2表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞株HepG2-HBx的鑒定

應(yīng)用Western blotting檢測(cè)HepG2-HBx及對(duì)照細(xì)胞HepG2-control的HBx蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，前者有明顯的HBx表達(dá)，后者則為陰性，表明表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞株HepG2-HBx構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1C。

3HBx蛋白對(duì)HepG2-HBx肝癌細(xì)胞P4啟動(dòng)子甲基化水平及P4mRNA表達(dá)水平的影響

根據(jù)人IGF-II基因P4啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了P4啟動(dòng)子的-555～-248片段，該片段共含有18個(gè)CpG位點(diǎn)。亞硫酸氫鹽測(cè)序結(jié)果顯示，HepG2-HBx細(xì)胞中甲基化CpG位點(diǎn)的比例(9.0%)明顯低于其對(duì)照細(xì)胞HepG2-control(25.0%)，P<0.01,見(jiàn)圖2。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，HepG2-HBx細(xì)胞P4 mRNA表達(dá)水平約為其對(duì)照細(xì)胞HepG2-control的2.8倍,見(jiàn)圖2。

Figure 2. Analysis of the P4 promoter methylation status (A;2=13.009，P<0.01) and P4 mRNA expression (B) ofICF-IIgene in HepG2-HBx cell line and HepG2-control cell line.Each row of circles represented sequencing results of a clone; TSS: transcription start site±s.n=6.**P<0.01vsHepG2-control..

圖2HepG2-HBx及對(duì)照細(xì)胞HepG2-control中P4啟動(dòng)子甲基化水平及P4mRNA表達(dá)水平分析

4HBx蛋白對(duì)體外甲基化pGL3-P4質(zhì)粒上P4啟動(dòng)子甲基化水平及轉(zhuǎn)錄活性的影響

根據(jù)pGL3-P4重組質(zhì)粒上pGL3-Basic載體及P4啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物(2條上游引物序列位于pGL3-Basic載體上)，采用巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增pGL3-P4質(zhì)粒上P4啟動(dòng)子的-1 129～-924片段，該片段共含有22個(gè)CpG位點(diǎn)。亞硫酸氫鹽測(cè)序結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染pCMV-tag2B-X質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中P4啟動(dòng)子-1 129～-924片段甲基化CpG位點(diǎn)的比例(60.8%)明顯低于共轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pCMV-tag2B的HepG2細(xì)胞(84.1%)，P<0.01，見(jiàn)圖3。另一方面，雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，前者P4啟動(dòng)子相對(duì)熒光素酶活性(14.12±0.89)明顯高于后者(4.61±0.76)，P<0.01，見(jiàn)圖3。

討 論

HBx是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，在HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，但其致癌機(jī)制復(fù)雜，許多環(huán)節(jié)尚未明確。目前的資料顯示，其作用機(jī)制可能涉及以下幾個(gè)方面。(1)HBx可反式激活各種病毒和細(xì)胞啟動(dòng)子[6]。(2)HBx參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。在肝細(xì)胞感染HBV早期，HBx抑制凋亡，使基因突變得以積累；在晚期，HBx誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)HBV復(fù)制及感染擴(kuò)散，逃避宿主細(xì)胞免疫功能，使癌前肝細(xì)胞得以存活，并進(jìn)一步惡性轉(zhuǎn)化[7-9]。(3)通過(guò)表觀遺傳機(jī)制導(dǎo)致腫瘤抑制基因等DNA序列的甲基化狀態(tài)異常等[10-11]。

人IGF-II是一種重要的胎兒生長(zhǎng)因子及有絲分裂原，在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化等方面均有重要作用。IGF-II的表達(dá)具有組織和發(fā)育階段特異性。在胎兒的肝臟、腎臟、小腸、肺臟、大腦皮層等組織具有高濃度的IGF-II mRNA表達(dá)，出生后急劇減少，但成人肝臟仍有一定水平的IGF-II mRNA表達(dá)[12-13]。IGF-II基因的這種表達(dá)特征與其復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)，即含有9個(gè)外顯子和4個(gè)啟動(dòng)子有關(guān)。在個(gè)體不同組織及不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，4個(gè)啟動(dòng)子呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)活性，總共編碼5種5′端非翻譯區(qū)不同的IGF-II mRNA，但其成熟蛋白產(chǎn)物相同。例如，在胎肝和新生兒肝中，啟動(dòng)子P2-P4被激活，P1失活，其中P3活性最大而致IGF-II mRNA大量表達(dá)；在出生2個(gè)月后，肝臟IGF-II mRNA表達(dá)量則顯著下調(diào)，約為新生兒峰值的1/10，一直至成人期都維持于此低水平狀態(tài)，其表達(dá)主要受控于P1啟動(dòng)子，P2和P4啟動(dòng)子活性弱，而P3啟動(dòng)子在大多數(shù)成人肝臟呈關(guān)閉狀態(tài)[13]。

Figure 3. Analysis of methylation levels (A:2=23.922,P<0.01) and the relative luciferase activity (B) of P4 promoter 48 h after co-transfection ofinvitromethylated pGL3-P4 vector and pCMV-tag2B-X or control empty plasmid pCMV-tag2B into HepG2 cells.Each row of circles represented sequencing results of a clone; TSS: transcription start site±s.n=6.**P<0.01vsHepG2 (2).

圖3體外甲基化pGL3-P4載體與pCMV-tag2B-X或?qū)φ湛召|(zhì)粒pCMV-tag2B共轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞48h后P4啟動(dòng)子甲基化水平及相對(duì)熒光素酶活性分析

研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化狀態(tài)異常與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在許多腫瘤中基因組DNA存在廣泛低甲基化和局部區(qū)域高甲基化共存現(xiàn)象。一般說(shuō)來(lái)，真核基因啟動(dòng)子高甲基化可抑制該基因表達(dá)，而低甲基化則促進(jìn)其表達(dá)[14]。 近年發(fā)現(xiàn)，IGF-II在動(dòng)物模型和人類肝臟的癌前病變及肝癌組織中呈過(guò)量表達(dá)，且IGF-II過(guò)表達(dá)與P3、P4啟動(dòng)子的再激活密切相關(guān)[1, 2, 15]。P4啟動(dòng)子再激活的機(jī)制可能有多個(gè)方面。我們前期發(fā)現(xiàn)：與正常成人肝組織相比，肝癌組織中P4啟動(dòng)子甲基化水平明顯降低，且DNA低甲基化是P4啟動(dòng)子再激活的機(jī)制之一[3]。但是，引起P4啟動(dòng)子低甲基化的原因及發(fā)生機(jī)制尚不明確。Su等[16]檢測(cè)了419例肝癌組織，結(jié)果顯示絕大多數(shù)標(biāo)本同時(shí)存在IGF-II和HBx蛋白表達(dá)；我們前期的研究顯示：在HBV相關(guān)的肝癌患者中，絕大多數(shù)肝癌組織存在P4啟動(dòng)子低甲基化及P4 mRNA高表達(dá)[2-3]。這些結(jié)果提示，HBx蛋白表達(dá)或HBV感染可能促進(jìn)肝癌組織IGF-II基因過(guò)表達(dá)。但二者之間確切的關(guān)系及其作用機(jī)制尚未明確。

在本研究中，我們構(gòu)建了表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞株HepG2-HBx，結(jié)果顯示，HepG2-HBx細(xì)胞P4啟動(dòng)子-555～-248片段甲基化CpG位點(diǎn)的比例明顯低于其對(duì)照細(xì)胞HepG2-control，而其P4 mRNA表達(dá)水平則為其對(duì)照細(xì)胞HepG2-control的2.8倍，提示HBx蛋白可降低P4啟動(dòng)子甲基化水平，進(jìn)而促進(jìn)IGF-II基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述研究結(jié)果，我們構(gòu)建了P4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)告載體pGL3-P4，將其體外甲基化后與含HBx基因的pCMV-tag2B-X質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染pCMV-tag2B-X質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中pGL3-P4載體上P4啟動(dòng)子-1 129～-924片段甲基化CpG位點(diǎn)的比例明顯低于共轉(zhuǎn)染其對(duì)照空質(zhì)粒pCMV-tag2B的HepG2細(xì)胞，而其P4啟動(dòng)子相對(duì)螢光素酶活性則明顯高于后者。上述兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBx蛋白可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞IGF-II基因P4啟動(dòng)子甲基化水平降低，進(jìn)而上調(diào)P4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)IGF-II基因表達(dá)。本結(jié)果與Zheng等[10]報(bào)道相似，他們發(fā)現(xiàn)HBx蛋白可部分或完全阻止DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNA methyltransferases 3A，DNMT3A)與CDH6基因的啟動(dòng)子結(jié)合，引起其低甲基化從而激活轉(zhuǎn)錄。Park等[17]也發(fā)現(xiàn)，HBx蛋白可下調(diào)DNMT3B表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞基因組DNA衛(wèi)星2重復(fù)序列低甲基化。

本研究結(jié)果將與肝癌發(fā)生有關(guān)的兩個(gè)重要因素——HBx蛋白與IGF-II基因過(guò)表達(dá)聯(lián)系起來(lái)，一方面為全面深入認(rèn)識(shí)HBx蛋白致肝細(xì)胞癌分子機(jī)制補(bǔ)充了新資料，另一方面為進(jìn)一步闡明肝癌發(fā)生中P4啟動(dòng)子低甲基化的原因及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[1] Breuhahn K, Schirmacher P. Reactivation of theinsulin-likegrowthfactor-IIsignaling pathway in human hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(11):1690 -1698.

[2] Tang SH, Yang DH, Huang W, et al. Differential promoter usage for insulin-like growth factor-II gene in Chinese hepatocellular carcinoma with hepatitis B virus infection[J]. Cancer Detect Prev, 2006, 30(2):192-203.

[3] Tang SH, Yang DH, Huang W, et al. Hypomethylated P4 promoter induces expression of the insulin-like growth factor-II gene in hepatocellular carcinoma in a Chinese population[J]. Clin Cancer Res, 2006, 12(14): 4171-4177.

[4] Shon JK, Shon BH, Park IY, et al. Hepatitis B virus-X protein recruits histone deacetylase 1 to repress insulin-like growth factor binding protein 3 transcription[J]. Virus Res, 2009, 139(1):14-21.

[5] Liao B, Hu Y, Herrick DJ, et al. The RNA-binding protein IMP-3 is a translational activator of insulin-like growth factor II leader-3 mRNA during proliferation of human K562 leukemia cells[J]. J Biol Chem, 2005, 280(18):18517-18524.

[6] Ng SA, Lee C. Hepatitis B virus X gene and hepatocarcinogenesis[J]. J Gastroenterol, 2011, 46(8):974-990.

[7] Kew MC. Hepatitis B virus x protein in the pathogenesis of hepatitis B virus-induced hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2011, 26(Suppl 1):144-152.

[8] Lau JY, Xie X, Lai MM, et al. Apoptosis and viral hepatitis[J]. Semin Liver Dis, 1998, 18(7): 169-176.

[9] Assrir N, Soussan P, Kremsdorf D, et al. Role of the hepatitis B virus proteins in pro- and anti-apoptotic processes[J]. Front Biosci, 2010, 15:12-24.

[10]Zheng DL, Zhang L, Cheng N, et al. Epigenetic modification induced by hepatitis B virus X protein via interaction withdenovoDNA methyltransferase DNMT3A[J]. J Hepatol, 2009, 50(2):377-387.

[11]Zhu YZ, Zhu R, Fan J, et al. Hepatitis B virus x protein induces hypermethylation of p16INK4Apromoter via DNA methyl transferases in the early stage of HBV-associated hepatocarcinogenesis[J]. J Viral Hepat, 2010, 17(2): 98-107.

[12]Birnbacher R, Amann G, Breitschopf H,et al. Cellular localization of insulin-like growth factor II mRNA in the human fetus and the placenta: detection with a digoxigenin-labeled cRNA probe and immunocytochemistry[J]. Pediatr Res, 1998, 43(5):614-620.

[13]Li X, Cui H, Sandstedt B, et al. Expression levels of the insulin-like growth factor-II gene (IGF2) in the human liver: developmental relationships of the four promoters[J]. J Endocrinol, 1996, 149(1):117-124.

[14]Costello JF, Fruhwald MC. Aberrant CpG-island methylation has nonrandom and tumor-type-specific patterns[J]. Nat Genet, 2000, 24(7):132-138.

[15]Nussbaum T, Samarin J, Ehemann V, et al. Autocrine insulin-like growth factor-II stimulation of tumor cell migration is a progression step in human hepatocarcinogenesis[J]. Hepatology, 2008, 48(1):146-156.

[16]Su Q, Liu YF, Zhang JF, et al. Expression of insulin-like growth factor-II in hepatitis B cirrhosis and hepatocellular carcinoma: its relationship with hepatitis B virus antigen expression[J]. Hepatology, 1994, 19(4 pt 1): 788-799.

[17]Park IY, Sohn BH, Yu E, et al. Aberrant epigenetic modifications in hepatocarcinogenesis induced by hepatitis B virus X protein[J]. Gastroenterology, 2007, 132(4):1476-1494.

HBxreducesmethylationlevelofP4promoterandup-regulateshumanIGF-IIgenetranscription

TANG Shao-hui1, ZHANG Liang-peng1, WU Xiao-juan1, ZHANG Man-man1, WANG Kuang-jing1, ZHOU Hong-ke1, LUO Yu-hong2, CAO Ming-rong2

(1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:xiger66666@163.com)

AIM: To establish HepG2-HBx cell line stably expressing hepatitis B virus X protein (HBx) and to investigate the effect of HBx on the methylation status and transcription activity of human insulin-like growth factor II (IGF-II) gene P4 promoter.METHODSHBxgene was cloned into the pBABE-puro retrovirus vector to construct recombinant plasmid pBABE-puro-HBx. The latter was transfected into 293FT package cells to generate retrovirus-pBABE-puro-HBx. HepG2 cells were infected with the virus suspension and the resistant cell clones were selected by puromycin. HBx expression in the HepG2-HBx cells was analyzed by Western blotting. P4 promoter methylation status and P4 mRNA expression in HepG2-HBx cells and HepG2-control cells were detected by bisulfite sequencing and real-time fluorescence quantitative RT-PCR, respectively. Furthermore,invitromethylated pGL3-P4 vector driven by P4 promoter of human IGF-II gene was co-transfected into HepG2 cells with pCMV-tag2B-X plasmid carryingHBxgene or control empty plasmid pCMV-tag2B, and the methylation status and transcription activity of P4 promoter in pGL3-P4 vector were analyzed by bisulfite sequencing and dual-luciferase reporter assay system, respectively.RESULTSHepG2-HBx cell line stably expressing HBx was successfully constructed. The percentage of methylated CpG dinucleotides in P4 promoter was lower in HepG2-HBx cells (9.0%) than that in HepG2-control cells (25.0%) (P<0.01), and P4 mRNA expression level of the former was 2.8 times higher than that of the latter. The percentage of methylated CpG dinucleotides in P4 promoter at pGL3-P4 vector was lower in the HepG2 cells co-transfected with pCMV-tag2B-X (60.8%) than that in the HepG2 cells co-transfected with control empty plasmid pCMV-tag2B (84.1%) (P<0.01), and the relative luciferase activity of the former (14.12±0.89) was higher than that of the latter (4.61±0.76) (P<0.01).CONCLUSIONHBx may reduce the methylation level of P4 promoter and up-regulates humanIGF-IIgene transcription.

Hepatitis B virus X protein; Insulin-like growth factor II; Promoters; DNA methylation

R735

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.017