MicroRNA－450a－3p 通過抑制Bub1 基因的表達(dá)調(diào)控小鼠細(xì)胞增殖和胚胎發(fā)育*

劉 晨， 楊丹丹， 蔣鳳兵， 白慧麗， 李寶林， 羅 敏， 湛曉琴， 施 瓊

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室，重慶400016)

自然流產(chǎn)的發(fā)生率約占臨床妊娠的10% ～20%，其中因染色體數(shù)目異常引起的自然流產(chǎn)為總數(shù)的50%左右［1］，而染色體數(shù)目異常胚胎細(xì)胞的發(fā)生機制至今尚不清楚。胚胎細(xì)胞的正常分裂是胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了確保分裂的正確性，真核生物細(xì)胞內(nèi)形成一套監(jiān)護網(wǎng)絡(luò)即紡錘體組裝檢查點(spindle assembly checkpoint，SAC)。染色體著絲粒行使檢查點功能時，關(guān)卡蛋白(checkpoint，CP)起著重要作用［2］，其中Bub1 是最主要的組件蛋白之一，且Bub1 基因表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞分裂染色體異常，進而影響細(xì)胞增殖和胚胎發(fā)育。最近發(fā)現(xiàn)，microRNA(miRNA)在胚胎干細(xì)胞的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要作用，Perera 等［3］認(rèn)為miRNA 可能通過調(diào)控Bub1 的mRNA 和/或蛋白水平影響胚胎發(fā)育。經(jīng)過生物信息學(xué)方法預(yù)測，miR-450a-3p 可以調(diào)控靶基因Bub1 的表達(dá)。本文旨在以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)為研究對象，通過應(yīng)用miR -450a -3p 模擬體(mimic)確定miR-450a -3p 能特異性結(jié)合Bub1 的3’- 非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，利用Western blotting、實時定量PCR (quantitative real - time PCR，qRT -PCR)等方法探究miR -450a -3p 對Bub1 表達(dá)的調(diào)控機制，以及miR-450a-3p 對MEFs 增殖、凋亡、細(xì)胞周期和染色體數(shù)目的影響，為臨床治療自然流產(chǎn)、防治胚胎發(fā)育異常提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和腺病毒 HEK -293 細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究室提供;表達(dá)Bub1 3’-UTR 熒光報告基因載體pMIR -3’、用于轉(zhuǎn)染效率校正的表達(dá)半乳糖苷酶的熒光報告基因載體pMIR-REPORT β-gal 對照質(zhì)粒、包含有與miR-450a-3p mimic 高度互補的MRE(miRNA response element)熒光報告基因載體MRE -450a -3p(5’-ATGAATGCAAAGCATCCCCAAT - 3’)和分別包含Bub1 3’-UTR 兩種突變的螢光素酶報告基因載體Bub1 3’- UTR mut1(5’- ATGCTTAATGGACCTTCTCCAAAA-3’)、Bub1 3’-UTR mut2(5’-AATGAATATGGACCTTCTGGTTAA -3’)由本實驗室前期利用Promega 雙報告螢光素酶檢測試劑盒構(gòu)建;過表達(dá)Bub1 的重組腺病毒Ad-Bub1 由本實驗室前期構(gòu)建。

1.2 主要試劑和儀器 miR -450a -3p mimic 及陰性對照mimic 購自廣州銳博生物科技有限公司，miR-450a -3p mimic 序列為5’- AUUGGGGAUGCUUUGCAUUCAU-3’，陰性對照mimic 序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’;DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素購自HyClone，脂質(zhì)體Li-

pofectamine 2000、Trizol 購自Invitrogen，逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、qRT - PCR 試劑盒購自TaKaRa，MTT、DMSO、ECL 試劑盒和秋水仙素購自Sigma，氯化鉀、甲醇、冰醋酸購自重慶川東試劑公司，Hoechst 染色試劑盒購自北京晶美公司，Giemsa 染色試劑盒購自南京建成生物公司。Bub1 抗體和β - actin 抗體均購自Santa Cruz，HRP 標(biāo)記的鼠抗羊IgG(用于Bub1 蛋白檢測)和羊抗鼠IgG(用于β -actin 檢測)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。qRT - PCR 儀購自Corbett，垂直電泳槽購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，Western blotting 顯影儀購自Bio -Rad，濃度測定儀購自Thermo，MTT 檢測用酶標(biāo)儀購自Sunrise，熒光素酶報告分析儀購自Promega。細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板均購自Corning。

2 方法

2.1 MEFs 的制備、培養(yǎng)和分組 無菌條件下取14.5 胚齡(days postcoitum，dpc)的小鼠胚胎，移去胚胎的四肢和內(nèi)臟，并棄之。留下頭的下部，移去腦部或含有腦的頭上部。剪碎后經(jīng)胰酶消化后在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM 高糖培養(yǎng)基(加入10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素)。取5 代以內(nèi)對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的Mefs 細(xì)胞，隨機分為3 組:(1)空白對照組:未做任何處理;(2)陰性對照組:轉(zhuǎn)染control mimic組;(3)實驗組:轉(zhuǎn)染miR -450a -3p mimic 組。相同條件重復(fù)3 次。

2.2 qRT-PCR 檢測miR -450a -3p mimic 轉(zhuǎn)染前后miR-450a -3p 水平 Trizol 法分別提取3 組細(xì)胞總RNA，低溫送至廣州銳博生物科技有限公司進行qRT-PCR 檢測成熟miR -450a -3p 的表達(dá)，每組實驗重復(fù)3 次。

2.3 螢光素酶報告基因檢測實驗 將MEFs 以30%密度接種于6 孔板，按LipofectamineTM2000 說明轉(zhuǎn)染實驗干預(yù)因素，實驗分組同前，同時共轉(zhuǎn)染pMIR-3’，設(shè)3 個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染36 h 后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，收獲細(xì)胞，每孔加入200 μL 細(xì)胞裂解液，室溫輕微振蕩15 min。在熒光素酶報告分析儀專用檢測板每孔加入30 μL 熒光素酶催化底物，再加入20 μL 細(xì)胞裂解產(chǎn)物后混勻，測定熒光素酶活性，每組實驗重復(fù)3 次。所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過Promega 雙報告系統(tǒng)pMIR -REPORT β -gal 對照質(zhì)粒為內(nèi)參校正后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.4 Western blotting 檢測miR-450a-3p mimic 轉(zhuǎn)染前后Bub1 蛋白水平 接種MEFs 以60%密度接種于直徑為10 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期，按LipofectamineTM2000 的說明轉(zhuǎn)染實驗干預(yù)因素，實驗分組同前。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，48 h 后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量。各取200 μL 樣品上樣進行SDS -PAGE，Ⅰ抗分別為Bub1抗體(1∶500)和β -actin 抗體(1∶1 000)，Ⅱ抗分別為鼠抗羊IgG(1∶5 000)和羊抗鼠IgG(1∶5 000)，最后按ECL 試劑盒說明進行電化學(xué)發(fā)光檢測，并用Bio -Rad顯影儀采集圖像。

2.5 qRT-PCR 檢測miR -450a -3p mimic 轉(zhuǎn)染前后Bub1 mRNA 水平 Trizol 法分別提取3 組細(xì)胞總RNA，濃度儀測定樣品純度和含量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的方法逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)后的cDNA 作為PCR 的模板進行PCR 擴增。Bub1 上游引物5’-TGGTTGAACAAGTCCACAGC - 3’，下游引物5’-CTGACCCAGGTCAATCAATG - 3’。內(nèi)參照選用小鼠的GAPDH，上游引物5’-GGCTGCCCAGAACATCAT-3’，下游引物5’-CGGACACATTGGGGGTAG-3’。反應(yīng)體系為:cDNA 2 μL，SyberGreen Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 12 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃變性60 s;95 ℃30 s，59 ℃20 s，72 ℃20 s，共35 個循環(huán)。以Bub1 mRNA 拷貝數(shù)與內(nèi)參照GAPDH mRNA 拷貝數(shù)的比值為Bub1 的相對表達(dá)量。

2.6 MTT 檢測miR -450a -3p 對MEFs 增殖的影響 用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，以每孔500 個接種于96 孔板中，加入200 μL DMEM 完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后加入實驗干預(yù)因素，另設(shè)一組同時經(jīng)miR-450a-3p mimic 和Ad -Bub1 處理，共4 組。每組設(shè)置10 個復(fù)孔。于0 h、12 h、24 h、36 h、48 h 和60 h 分別加入20 μL MTT，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄上清。再加入150 μL DMSO，振蕩搖勻，酶標(biāo)儀測定各孔490 nm A 值，重復(fù)3 次。

2.7 Hoechst 染色檢測miR -450a -3p 對MEFs 凋亡的影響 用0. 25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞，以每孔500 個接種于96 孔板中，加入200 μL DMEM 完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后加入實驗干預(yù)因素，另設(shè)一組同時經(jīng)miR -450a -3p mimic 和Ad - Bub1處理，共4 組。每組設(shè)置3 個復(fù)孔。48 h 后，每孔依次加入細(xì)胞染色緩沖液100 μL，Hoechst 染色液0.5 μL，冰浴30 min，PBS 洗滌1 次，熒光顯微鏡下計數(shù)300 個細(xì)胞。凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-450a-3p 對MEFs 細(xì)胞周期的影響 用0.25%、不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集加入實驗干預(yù)因素0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h 的3 組細(xì)胞，PBS 洗滌2 次后，重懸于預(yù)冷的70%乙醇。4 ℃保存，上流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期(由重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院兒研所完成檢測)。每組設(shè)3 個平行樣本，實驗重復(fù)3 次。

2.9 染色體核型分析檢測miR -450a -3p 對Mefs細(xì)胞染色體數(shù)目的影響 細(xì)胞傳代24 h 后，經(jīng)觀察有較多分裂期細(xì)胞，加入終濃度為0.3 mg/L 的秋水仙素處理3 h，使分裂的細(xì)胞停止于有絲分裂中期。隨后胰酶消化收集細(xì)胞，再經(jīng)0.075 mol/L KCl 低滲膨脹細(xì)胞，減少染色體間的相互纏繞和重疊，最后用甲醇和冰醋酸將細(xì)胞固定于載玻片上，經(jīng)Giemsa 染色后在顯微鏡下計數(shù)300 個細(xì)胞，觀察染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 miR－450a－3p mimic 能夠上調(diào)MEFs 中miR－450a－3p 的表達(dá)

經(jīng)qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，加入外源性miR-450a-3p mimic，與陰性對照組相比，miR-450a -3p的表達(dá)明顯增加4.4 倍(P ＜0.01)，見圖1。

Figure 1. The expression of miR-450a-3p in MEFs quantified by qRT - PCR. MEFs were transfected with miR -450a-3p mimic for 48 h. ±s.n =3. ＊＊P ＜0.01 vs control mimic group.圖1 qRT－PCR 檢測miR－450a－3p mimic 轉(zhuǎn)染前后miR－450a－3p 水平

2 miR－450a－3p 通過靶作用于Bub1 3’－UTR調(diào)控Bub1 表達(dá)

螢光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，經(jīng)pMIR -3’和miR-450a -3p mimic 共轉(zhuǎn)染的MEFs 的螢光素酶活性比陰性對照組下降57% (P ＜0. 01)，見圖2A。經(jīng)序列分析，我們發(fā)現(xiàn)Bub1 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’-UTR 在終止密碼子后與miR -450a -3p 有14個堿基互補，見圖2C。

為了驗證以上結(jié)果，將pMIR-3’與MRE-450a-3p 進行共轉(zhuǎn)染，與陰性對照組相比，MEFs 的螢光素酶活性被抑制了90%左右(P ＜0.01)，見圖2B。同時，把Bub1 3’-UTR 與miR-450a-3p 結(jié)合的位點做了突變，見圖2C，并進行轉(zhuǎn)染，可以看到突變mut1 和mut2 均能夠使螢光素酶活性明顯升高，也就是抑制了miR-450a-3p 與Bub1 3’-UTR 的結(jié)合，見圖2B。

Figure 2. miR-450a-3p binds to the 3'-UTR of mouse Bub1 mRNA. A:luciferase activity of MEFs after cotransfected with pMIR - 3' vector and miR - 450a - 3p mimic. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs pMIR -3'+control mimic group. B:luciferase activity of MEFs after transfected with Bub1 3' - UTR - wt，450a - MRE，Bub1 3'-UTR-mut1 or Bub1 3'-UTR-mut2 in the presence of miR-450a -3p mimic. ±s. n =3. ＊＊P＜0.01 vs control mimic group. C:sequences of the miR-450a-3p binding sites within mouse Bub1 mRNA (Bub1 3'-UTR)，wild -type 3'-UTR of Bub1(Bub1 3'-UTR -wt)and mutant 3'-UTR nucleotides of the miR-450a-3p binding sites (Bub1 3'-UTR-mut1 and Bub1 3'-UTR-mut2).圖2 螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR－450a－3p 與Bub1 3’－UTR 的結(jié)合

3 miR－450a－3p 干擾MEFs 中Bub1 蛋白水平的表達(dá)

Western blotting 檢測MEFs 中Bub1 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與空白對照相比，實驗組細(xì)胞Bub1 蛋白明顯減少(P ＜0.01)，而陰性對照組與空白對照組之間差別不大，表明MEFs 轉(zhuǎn)染miR-450a-3p 會使Bub1 蛋白水平明顯減少，見圖3。

Figure 3. Bub1 protein expression in MEFs 48 h after transfected with miR-450a -3p mimic was detected by Western blotting. ± s. n = 3. ＊＊P ＜0. 01 vs control mimic group.圖3 Western blotting 檢測miR－450a－3p mimic 轉(zhuǎn)染前后Bub1 蛋白的表達(dá)

4 miR－450a－3p 干擾MEFs 中Bub1 mRNA 水平的表達(dá)

qRT - PCR 檢測MEFs 中Bub1 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與空白對照相比，實驗組細(xì)胞和陰性對照組細(xì)胞Bub1 mRNA 表達(dá)水平的變化均不明顯，無顯著差異，表明MEFs 轉(zhuǎn)染miR-450a-3p 并不會使Bub1 轉(zhuǎn)錄水平改變，見圖4。

5 miR－450a－3p 對MEFs 增殖和凋亡的影響

MTT 法檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，經(jīng)mimic 處理后36 h 內(nèi)，3 組細(xì)胞增殖率間沒有明顯差異，而60 h時與空白對照組相比，實驗組細(xì)胞增殖率明顯減低(P ＜0.01)，而陰性對照組與空白對照組之間無顯著差異。但在加入miR - 450a - 3p 的同時過表達(dá)Bub1，細(xì)胞增殖率相比較對照組不會出現(xiàn)明顯的下降。這表明miR-450a-3p 可以抑制MEFs 的增殖，且加入外源性的Bub1 能干擾這種抑制，見圖5A。

Figure 4. Bub1 mRNA expression in MEFs 48 h after transfected with miR -450a -3p mimic was detected by qRT -PCR. ±s.n=3.圖4 qRT－PCR 檢測miR－450a－3p mimic 轉(zhuǎn)染前后Bub1 mRNA 的表達(dá)

Hoechst 染色檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，經(jīng)mimic處理后48 h，與空白對照組相比，實驗組細(xì)胞凋亡的百分比明顯增加，Hoechst 染色細(xì)胞陽性率由2.33%上升至7.85%(P ＜0.01)。而陰性對照組Hoechst染色細(xì)胞陽性率為2.58%，與空白對照組之間無顯著差異。但在加入miR -450a -3p 的同時過表達(dá)Bub1，Hoechst 染色細(xì)胞陽性率相比較對照組不會出現(xiàn)明顯的升高。這表明miR -450a -3p 可以引起MEFs 的凋亡，且加入外源性的Bub1 能干擾其促凋亡的作用，見圖5B、C。

6 miR－450a－3p 對MEFs 細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，經(jīng)mimic 處理后48 h，與空白對照組相比，實驗組細(xì)胞大多數(shù)被阻滯在G1/G0期，由35.89%上升至55.04%(P ＜0.01)，而陰性對照組細(xì)胞G1/G0期占39.38%，與空白對照組之間無顯著差異，見圖6。這就說明在Mefs細(xì)胞中miRNA-450a-3p 所引起的Bub1 表達(dá)的下調(diào)，會導(dǎo)致SAC 功能異常，多數(shù)細(xì)胞過早地停止分裂，被阻滯在G1/G0期。

Figure 5. Effects of miR-450a -3p on proliferation and apoptosis of MEFs. A:the proliferation of MEFs was measured using the MTT;B:the apoptosis of MEFs was measured using Hoechst staining (×200);C:300 cells were counted in every experiment to calculate the Hoechst positive cell percentage. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control mimic group.圖5 miR－450a－3p mimic 轉(zhuǎn)染前后增殖和凋亡的變化

Figure 6. Effects of miR-450a-3p on cell cycle of MEFs. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control mimic group.圖6 miR－450a－3p mimic 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期的變化

7 miR－450a－3p 對細(xì)胞染色體數(shù)目的影響

染色體核型分析結(jié)果顯示，與空白對照組相比，實驗組細(xì)胞染色體數(shù)目異常率由4. 75% 上升至28.74%(P ＜0.01)，而陰性對照組細(xì)胞染色體數(shù)目異常率為5.02%，與空白對照組之間無顯著差異，見圖7A。由miR -450a -3p 所引起的染色體數(shù)目異常有非整倍體和多倍體，其中非整倍體包括XXY 和2n-1，多倍體包括3n 和4n，見圖7B。

Figure 7. Abnormal karyotype in MEFs with overexpressed miR-450a -3p. A:abnormal karyotype cell percentage.±s.n=3. ＊＊P ＜0. 01 vs control mimic group. B:presentative abnormal karyotypes of MEFs in miR -450a-3p group (Giemsa staining).圖7 miR－450a－3p mimic 轉(zhuǎn)染前后染色質(zhì)核型分析

討 論

近年來，國內(nèi)外對miRNA 的研究不斷增多，人們逐漸認(rèn)識到其在基因表達(dá)調(diào)控中的重要性。miRNA 是一類大小約21 ～23 個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，由pri-miRNA 經(jīng)Drosha 處理和Dicer 剪切所生成［4］。通常miRNA 可識別特異的mRNA，并通過不完全配對靶結(jié)合到mRNA 的3’-UTR，影響靶向mRNA 的穩(wěn)定性或抑制其翻譯，進而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［5］，這就揭示了一個嶄新的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機制［6］。而對miRNA 的研究，大多數(shù)都是通過體外構(gòu)建miRNA 的模擬體miRNA mimics 實現(xiàn)的。Bernstein 等［7］指出，敲除Dicer 這一miRNA 生成過程中重要的核酸酶會導(dǎo)致小鼠胚胎在7.5 dpc 前死亡。同時，Perera 等［3］證明了敲除Bub1 的小鼠胚胎在3.5 dpc 后也會死亡。這些結(jié)果說明miRNA 在胚胎干細(xì)胞的增殖分化和早期胚胎發(fā)育中起著重要作用，而這一作用很可能是通過靶作用于Bub1 來實現(xiàn)的。

Bub1 作為CP 的主要組件蛋白之一［8］，可以通過調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性起到調(diào)節(jié)紡錘體微管和著絲粒連接的作用，在有絲分裂過程中監(jiān)控染色體正確排列和等量分離，為細(xì)胞有絲分裂的正常進行提供保障。此前有學(xué)者指出Bub1 失調(diào)所致的SAC 病變在腫瘤形成過程中有重要作用［9］。我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)Bub1 基因的缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎細(xì)胞有絲分裂出現(xiàn)異常，這不僅會導(dǎo)致細(xì)胞染色體數(shù)目的異常，還會改變細(xì)胞周期、中止細(xì)胞分裂甚至細(xì)胞的死亡。同時，在對人類自然流產(chǎn)胚胎細(xì)胞的分析中也發(fā)現(xiàn)有明顯的Bub1 下調(diào)以及染色體核型異常［10］。

本實驗室在前期研究中，通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)有8 種miRNA 均能靶作用于Bub1 3’-UTR，分別是miRNA -30a、30e、297b、450a -3p、466a -3p、467a、467e 和494，其中miR -450a -3p 的作用尤為顯著。miR-450a-3p 在多種組織中廣泛表達(dá)，但對其生物學(xué)功能知之甚少，僅僅有研究指出其在子宮內(nèi)膜癌肉瘤和前列腺癌［11］中有表達(dá)差異，但是差異都不大。在本實驗中，以Bub1 基因作為主要研究對象，通過螢光素酶報告實驗證實了miR -450a -3p可以下調(diào)pMIR -3’的熒光素酶活性，即靶作用于Bub1 3’-UTR。隨后，我們又用了2 個方法來驗證以上結(jié)論:(1)將MRE -450a -3p 與miR -450a -3p mimic 共轉(zhuǎn)染HEK-293 細(xì)胞。MRE 主要存在于mRNA 的3’UTR 中，內(nèi)含7 個堿基大小的特征性位點能與相對應(yīng)miRNA 的5’端高度結(jié)合［12］。我們可以看到共轉(zhuǎn)染MRE -450a -3p 能明顯抑制熒光素酶活性。(2)將Bub1 3’-UTR 區(qū)域的2 個miR -450a-3p 結(jié)合位點突變，構(gòu)建了突變體螢光素酶報告基因載體，與miR -450a -3p mimic 轉(zhuǎn)染HEK -293 細(xì)胞，與pMIR -3’相比，螢光素酶活性明顯恢復(fù)，證明miR-450a-3p 通過與Bub1 3’-UTR 的結(jié)合位點相結(jié)合發(fā)揮作用。

我們采用Western blotting 和qRT - PCR 的方法，發(fā)現(xiàn)實驗組的Bub1 蛋白水平有明顯降低，但是mRNA 水平受實驗干預(yù)因素的影響不大。這可能是因為miR-450a -3p 作為一個翻譯抑制子，主要是對基因表達(dá)翻譯水平的調(diào)節(jié)，但卻不會影響靶基因mRNA 水平的降解。但同時也有學(xué)者指出，有一些miRNA 會誘導(dǎo)靶作用mRNA 的降解從而抑制蛋白質(zhì)合成［13］，且miR-10a 能夠通過與核糖體蛋白mRNA 5’-UTR 結(jié)合增強翻譯，而不是抑制翻譯［14］。因此miRNA 調(diào)控基因表達(dá)方式的不同，也成為miRNA 研究中一個急需解決的問題。

本文結(jié)果同時也表明，過表達(dá)miR -450a -3p會通過下調(diào)Bub1 的表達(dá)而抑制MEFs 的增殖，這與Perera 等［3］指出的Bub1 缺失會影響MEFs 增殖的結(jié)論是一致的。究其抑制增殖的原因可能有2 個:(1)促進Mefs 細(xì)胞的凋亡;(2)將細(xì)胞大量阻滯在G1/G0期，使細(xì)胞過早地停止分裂。同時經(jīng)過染色體核型分析，可以看到非整倍體、多倍體等異常核型頻率增高，這與Perera 等［3］指出的Bub1 缺失致有絲分裂異常的結(jié)論也是一致的。

綜上所述，miR -450a -3p 能夠通過靶結(jié)合到Bub1 3’-UTR 并干擾Bub1 的表達(dá)，抑制胚胎細(xì)胞的增殖和發(fā)育，導(dǎo)致細(xì)胞染色體數(shù)目異常。為研究因染色體數(shù)目異常所導(dǎo)致的自然流產(chǎn)及產(chǎn)前診斷提供了新的思路，為提高臨床妊娠質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

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