糖尿病早期腦損傷與線粒體功能障礙*

耿喜林, 徐明麗, 尹 潔, 穆繼英, 張 朗, 景玉宏,4△

(1蘭州大學第二醫(yī)院創(chuàng)傷外科，甘肅 蘭州 730030；2甘肅省衛(wèi)生學校藥學教研室，甘肅 蘭州 730000；蘭州大學基礎醫(yī)學院 3人體解剖與組織胚胎學研究所，4 神經(jīng)科學研究所，甘肅 蘭州 730000)

1000-4718(2012)09-1571-06

2012-03-13

2012-06-05

國家自然科學基金資助項目(No. 30872731)；甘肅省自然科學基金資助項目(No.1010RJZA114)

△通訊作者 Tel: 0931-8915886；E-mail：jingyh@lzu.edu.cn

糖尿病早期腦損傷與線粒體功能障礙*

耿喜林1, 徐明麗2, 尹 潔3, 穆繼英3, 張 朗3, 景玉宏3,4△

(1蘭州大學第二醫(yī)院創(chuàng)傷外科，甘肅 蘭州 730030；2甘肅省衛(wèi)生學校藥學教研室，甘肅 蘭州 730000；蘭州大學基礎醫(yī)學院3人體解剖與組織胚胎學研究所，4神經(jīng)科學研究所，甘肅 蘭州 730000)

目的研究1型糖尿病早期階段腦損傷的主要病理原因，是否影響線粒體功能及其可能機制。方法SD大鼠經(jīng)股靜脈單次注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導高血糖，持續(xù)高血糖2個月后，檢測外周血、腦脊液及腦組織中葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇水平。取大鼠前額皮層，分離線粒體，檢測線粒體氧化及抗氧化水平，Western blotting檢測腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)磷酸化水平。全腦冰凍切片，F(xiàn)luo-Jade-C染色檢測神經(jīng)細胞損傷程度。電鏡檢測皮層錐體細胞自噬-溶酶體變化。結果1型糖尿病神經(jīng)損傷主要原因是高血糖，可以導致皮層Fluo-Jade-C陽性細胞增多，線粒體氧化水平升高，抗氧化能力下降，AMPK磷酸化水平下降。同時發(fā)現(xiàn)1型糖尿病大鼠皮層錐體細胞自噬體增多，自噬體內包裹有線粒體或線粒體殘余。結論1型糖尿病早期所致的腦損傷，與持續(xù)高血糖增加氧化應激，進而損傷線粒體功能有關，伴隨有自噬激活。

高血糖癥; 線粒體; 自噬; 腦

臨床研究表明，未嚴格控制血糖的1型糖尿病患者在早期即可出現(xiàn)腦損傷的癥狀，該損傷與高血糖、一過性低血糖及酮尿有關，主要病理表現(xiàn)為腦水腫，伴隨腦組織氧化應激相關指標的異常以及炎癥反應[1]。而腦內氧化應激及炎癥反應可能在糖尿病早期就已經(jīng)存在，并危害神經(jīng)元的代謝穩(wěn)態(tài)、細胞極性及營養(yǎng)供應[2]。1型糖尿病大鼠模型神經(jīng)損傷的機制也同樣與氧化應激及炎癥反應相關，近來更有研究認為代謝障礙及氧化應激是神經(jīng)退行性疾病(如老年性癡呆)的關鍵因素[3]。線粒體是細胞內的供能中心，也是氧自由基產(chǎn)生的關鍵細胞器，對氧化損傷較為敏感，氧化應激不僅損傷線粒體本身，同時通過線粒體信號，如細胞色素C信號啟動細胞凋亡，導致神經(jīng)元死亡。細胞代謝異常，尤其持續(xù)高糖刺激會激活細胞內自噬-溶酶體途徑，自噬在細胞穩(wěn)態(tài)調節(jié)中發(fā)揮重要作用，由于氧化應激所致的異常蛋白聚集及細胞器可以通過此途徑降解，通過自噬途徑實現(xiàn)代謝激發(fā)的適應性反應，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮細胞毒性效應[4]。在1型糖尿病早期，高血糖可能是關鍵的病理因素，葡萄糖氧化代謝的核心細胞器是線粒體，因此本實驗中我們重點觀察1型糖尿病模型大鼠在高血糖2個月后腦損傷情況、這一損傷對線粒體功能的影響和高糖狀態(tài)下線粒體的變化。

材 料 和 方 法

1動物

SD雄性大鼠，體重275～300 g，購自蘭州大學醫(yī)學實驗動物中心，全部動物實驗均得到蘭州大學實驗動物委員會批準。

2主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma；Fluo-Jade-C購自Chemicon；腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)及磷酸化AMPK抗體購自Bioworld；葡萄糖(glucose)、甘油三酯(triglyceride，TG)及總膽固醇(cholesterol，CHOL)測定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；PVDF膜及ECL發(fā)光劑均購自Millipore；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒及谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；其它試劑及耗材購自上海生物工程有限公司。

3主要方法

3.1動物模型 SD雄性大鼠，體重275～300 g，購自蘭州大學醫(yī)學實驗動物中心，動物飼養(yǎng)室保持22 ℃，60%濕度，12 h光照周期，自由攝食飲水，全部動物實驗均得到蘭州大學實驗動物委員會批準。適應性飼養(yǎng)1周后，禁食24 h，經(jīng)股靜脈1次性注射STZ(60 mg/kg，溶于生理鹽水中)，對照組經(jīng)股靜脈注射等量生理鹽水，1周后經(jīng)大鼠尾靜脈采血，檢測血糖，≥300 mg/dL作為高血糖大鼠，用于實驗，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，2個月后用于各項指標檢測。

3.2血漿、腦脊液和大腦皮層組織葡萄糖、TG和CHOL測定 造模后2個月大鼠(每組隨機選取10只)，10%水合氯醛麻醉(360 mg/kg)，暴露枕骨大孔，經(jīng)小腦延髓池穿刺抽取腦脊液，開胸，暴露心臟，經(jīng)心臟穿刺采血，離心分離血漿，利用酶底物試劑盒直接檢測血漿及腦脊液中葡萄糖、TG及CHOL含量。部分大鼠經(jīng)心臟采血后，快速經(jīng)冰生理鹽水灌注沖洗血液，冰臺上分離全腦，一側大腦皮層用于制作腦組織勻漿，一側大腦皮層用于提取總線粒體。腦組織勻漿制作：皮層稱重，加入0.01 mmol PBS[含100 mmol的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)及10 mmol的蛋白酶抑制劑apoprotin(100 g/L)]，低溫勻漿，超聲處理，呈混懸液，測定腦組織中葡萄糖、TG和CHOL，勻漿組織低溫離心(12 000×g, 20 min)，取上清，測定組織蛋白濃度。

3.3線粒體分離及鑒定 另一側大腦皮層置于冰的緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4, 1.8 mmol/L KH2PO4, 50 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl)中剪碎，并勻漿，加入線粒體提取液，低溫梯度離心，獲取線粒體組分，取少量，經(jīng)電子顯微鏡鑒定，純度在95%以上者用于后續(xù)實驗。

3.4線粒體MDA和GSH含量的測定 線粒體提取物，利用RIPA提取總蛋白(加入蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑)，并根據(jù)試劑操作說明書，檢測線粒體中MDA及GSH含量。

3.5血漿MDA分析 全血分離血漿，加入雙蒸水以5∶1比例稀釋，經(jīng)HPLC檢測血漿中MDA含量。

3.6Fluo-Jade-C檢測 每組5只大鼠經(jīng)心臟灌注固定。采用心臟灌注泵(壓力控制：28)，冰生理鹽水沖洗，4% PA-0.1 mol/L PB-buffer灌注固定。取腦，經(jīng)20%-30%蔗糖梯度處理，冰凍切片機連續(xù)冠狀切片，片厚30 μm。選取braggma -0.34平面，行Fluo-Jade-C染色。腦片經(jīng)100%-70%-30%梯度乙醇處理，蒸餾水沖洗，0.06% KMnO4處理15 min，0.001%Fluo-Jade-C染色40 min，避光，室溫反應。熒光顯微鏡觀察，拍照。

3.7Western blotting檢測線粒體提取物中AMPK磷酸化水平 上述線粒體提取的總蛋白，利用SDS-PAGE分離，轉印至PVDF膜，分別用AMPK及磷酸化AMPK抗體孵育，4 ℃過夜，TBST漂洗，對應的Ⅱ抗室溫孵育30 min，漂洗，ECL發(fā)光劑顯色，膠片曝光，定影、顯影，掃描，利用Image-Pro Plus軟件分析灰度，計算相對表達量。

3.8腦組織自噬體檢測 每組隨機選取3只大鼠前額皮層，2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，脫水，樹脂包埋，聚合，半薄定位錐體細胞層，超薄切片，觀察錐體細胞及周圍突起內自噬體數(shù)量及形態(tài)。

4統(tǒng)計學處理

結 果

11型糖尿病早期大鼠血漿、腦脊液和大腦皮層組織中葡萄糖、TG和CHOL的變化

為證明1型糖尿病早期外周代謝異常對中樞糖脂有無影響，我們在糖尿病大鼠2個月后分別檢測了模型和對照組大鼠外周血、腦脊液和皮層腦組織內葡萄糖、TG和CHOL的含量變化。結果表明，2個月后糖尿病大鼠血漿葡萄糖含量明顯增高，同時腦脊液中葡萄糖的含量也明顯高于正常對照組，但糖尿病大鼠腦組織葡萄糖含量下降，見表1。該結果表明1型糖尿病導致外周和中樞葡萄糖變化明顯，組織葡萄糖轉運異?？赡苁悄X組織葡萄糖水平較低的原因。我們也檢測了TG及CHOL在外周血、腦脊液及腦組織中的變化，結果發(fā)現(xiàn)各組之間無顯著差異。

2Fluo-Jade-C染色結果

表1結果表明，1型糖尿病不但導致外周血糖升高，同時也存在中樞性高血糖，神經(jīng)組織內葡萄糖水平下降，表明存在細胞葡萄糖利用障礙。為進一步研究該變化對皮層區(qū)域神經(jīng)細胞的損傷效應，我們通過Fluo-Jade-C染色，檢測皮層神經(jīng)細胞損傷狀況，(Fluo-Jade-C可以染色潰變的神經(jīng)元)。從染色結果可以觀察到，2個月后1型糖尿病大鼠皮層可見較多的Fluo-Jade-C染色的陽性神經(jīng)元出現(xiàn)，見圖1。

表11型糖尿病對大鼠血液、腦脊液和大腦皮層組織中葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇含量的影響

ItemGroupPlasma(mg/dL．n=18)Cerebrospinalfluid(mg/dL．n=18)Cerebralcortex[mg/(gprotein)．n=10]GlucoseNormal87．70±24．1545．67±14．70366．03±61．37DM331．64±35．33??141．51±15．20??268．29±32．60?TriglycerideNormal103．00±11．8075．16±0．68233．66±57．90DM164．00±41．9090．71±2．83132．88±29．20CholesterolNormal90．86±6．5045．40±2．431051．66±177．50DM153．86±32．6052．07±6．97921．89±65．40

*P<0.05,**P<0.01vsnormal.

Figure 1. Degenerative neurons were stained by Fluo-Jade-C in frontal cortex in STZ-induced diabetic rats. The arrows indicate degenerative neurons.

圖11型糖尿病對大鼠皮層神經(jīng)細胞潰變的影響

3線粒體檢測結果

考慮到1型糖尿病神經(jīng)損傷的關鍵因素是高血糖(高血糖可以導致顯著的氧化應激，從而波及細胞內的線粒體)，我們通過分離皮層組織的線粒體組分，并通過電子顯微鏡鑒定線粒體純度，見圖2。在此基礎上，我們檢測了線粒體氧化及抗氧化水平，結果可見當外周血中氧化損傷加劇，MDA含量升高時，腦組織線粒體MDA也同步升高，而線粒體抗氧化能力則下調，即GSH水平下降，見圖3。

4線粒體中能量感受分子AMPK磷酸化水平檢測結果

線粒體氧化應激可能會影響線粒體的氧化功能。我們檢測了線粒體中能量感受分子AMPK磷酸化水平，結果發(fā)現(xiàn)1型糖尿病大鼠腦內線粒體中AMPK磷酸化水平明顯下降，見圖4。

5糖尿病導致的線粒體損傷與自噬活化的關系

1型糖尿病可以導致線粒體損傷，功能異常的線粒體或其它細胞器會通過自噬-溶酶體途徑清除。我們對皮層組織進行電鏡檢測，發(fā)現(xiàn)皮層神經(jīng)元及其突起內出現(xiàn)較多的自噬-溶酶體結構，在這些自噬體中往往包含有線粒體結構，見圖5。這說明在1型糖尿病損傷中存在自噬激活。

Figure 2. Identification of mitochondria by electron microscopy. Mitochondria were observed in the isolated fraction.A:normal;B:diabetes mellitus.

圖2皮層組織線粒體分離鑒定

討 論

近年研究表明長期的2型糖尿病，或是未控制血糖的1型糖尿病會導致中樞神經(jīng)損傷，中樞神經(jīng)損傷的機制可能涉及多個方面，尤其長期糖尿病所致的代謝障礙，往往會損傷血管系統(tǒng)，波及腦內的小血管，導致血管硬化，血管炎癥反應，進而引發(fā)神經(jīng)病理改變[5]。但1型糖尿病早期，沒有形成明顯的血管病變，但由于胰島素水平低下，血糖過高，脂類代謝障礙成為腦損傷的潛在病理。本研究中，我們首先確定了糖尿病的主要損傷因素，通過檢測血漿、腦脊液和腦組織中葡萄糖、TG和CHOL含量，發(fā)現(xiàn)在1型糖尿病早期主要病因為高血糖，這一過度升高的血糖效應，不但存在于外周，同時也影響到腦脊液，這說明高血糖不但會影響外周器官，也會影響腦，雖然有血腦屏障這一結構，但對血液中高濃度葡萄糖似乎并無影響，腦脊液中葡萄糖濃度雖然低于外周，但糖尿病組大鼠腦脊液葡萄糖濃度依然高于對照組?？赡懿糠衷蚴且驗槟X內葡萄糖的代謝較少依賴葡萄糖轉運體4(glucose transporter 4，GLUT4)，已知GLUT4的葡萄糖轉運作用對胰島素具有依賴性[6]。另一方面，和外周器官比較，腦組織對葡萄糖的利用更高，這也許是腦脊液中葡萄糖濃度低于外周血的原因，但因為持續(xù)高血糖，以及腦內胰島素信號也有下降， 所以依然在糖尿病動物的腦脊液中檢測到較高的葡萄糖水平。而腦組織內葡萄糖水平則可以反映進入細胞內葡萄糖的量，這一結果發(fā)現(xiàn)糖尿病動物腦組織葡萄糖含量有下降，這意味著神經(jīng)細胞攝取葡萄糖的效率是下降的，該結果的確切機制可能較為復雜，因為胰島素信號除促進GLUT4的葡萄糖轉運外，在神經(jīng)保護、非GLUT4途徑的葡萄糖利用方面也發(fā)揮作用[7]，因此腦組織中葡萄糖濃度降低，一方面可能是因為葡萄糖轉運的問題，另一方面，可能和神經(jīng)細胞對葡萄糖的利用有關。

圖31型糖尿病對大鼠皮層組織內線粒體氧化和抗氧化能力的影響

圖4糖尿病大鼠皮層線粒體AMPK磷酸化水平的變化

Figure 5. Autophagysomes in the frontal cortex of rats were observed by electron microscopy. N:nucleus;DM:diabetic mellitus;D:dendrite. Black arrows indicate autophagysome;white triangles indicate mitochondria.

圖5大鼠前額皮層錐體細胞自噬分析

自由基累積導致線粒體損傷，會影響線粒體功能，線粒體是氧化代謝的核心細胞器，而AMPK分子對能量代謝異常敏感，AMPK通過磷酸化，活化下游的諸多通路，參與糖類、脂類及蛋白的利用[14- 15]。因此通過檢測AMPK活性，可以間接反映能量利用效率，通過對線粒體AMPK磷酸化水平檢測，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠皮層線粒體蛋白提取物中磷酸化AMPK水平降低。來自糖尿病外周器官損傷的眾多研究也發(fā)現(xiàn)類似結果，尤其是糖尿病大鼠骨骼肌和腎小球內AMPK活化水平下降，葡萄糖利用率降低[16]。能量利用效率和自噬活化之間有密切關系[17]，因為線粒體損傷以及腦組織葡萄糖利用率下降，可能會激活自噬，通過電子顯微鏡檢測，在神經(jīng)細胞胞體內可以觀察到更多的自噬體，正常狀態(tài)下，腦內自噬水平比較低，自噬體的半衰期很短，所以很難捕捉到廣泛出現(xiàn)的自噬體[18]。我們在正常動物腦內皮層錐體細胞中沒有觀察到太多的自噬體，而在糖尿病大鼠皮層錐體細胞中，則發(fā)現(xiàn)有異常增多的自噬體出現(xiàn)，這些自噬體內往往包裹了線粒體結構，或線粒體殘體，這說明該過程伴隨有自噬的活化，但自噬激活在此扮演的角色依然難下結論，可能自噬活化目的是為了清除功能異常的細胞器，也可能由于高糖持續(xù)狀態(tài)，導致自噬活化，成為加重損傷的原因，要澄清自噬體在此的作用，尚需要更多的實驗。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病腦損傷的關鍵因素是持續(xù)高血糖，高糖導致氧化應激，進而損傷神經(jīng)細胞線粒體，線粒體功能異常伴隨自噬活化，成為腦損傷的后續(xù)病理變化。

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Early-onsettype1diabetescausesbraininjuryandmitochondrialdysfunction

GENG Xi-lin1, XU Ming-li2, YIN Jie3, MU Ji-ying3, ZHANG Lang3, JING Yu-hong3,4

(1DivisionofTraumaticSurgery,theSecondHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730030,China;2DepartmentofPharmacy,GansuProvinceHealthSchool,Lanzhou730000,China;3InstituteofHumanAnatomy,HistologyandEmbryology,4InstituteofNeuroscience,SchoolofBasicMedicalSciences,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China.E-mail:jingyh@lzu.edu.cn)

AIM: To explore the main risk factors of diabetic encephalopathy and to investigate the changes of mitochondria in early-onset type 1 diabetes.METHODSSingle dose of streptozotocin was injected through the femoral vein to establish type 1 diabetes model in rats. The levels of glucose, triglyceride and cholesterol in plasma, cerebrospinal fluid and cerebral cortex were measured. Oxidative and antioxidative status was evaluated by determining the levels of malondialdehyde and glutathione in the isolated mitochondria of cerebral cortex. Furthermore, the level of active AMP-activated protein kinase (AMPK) in the isolated mitochondria was detected by Western blotting. Degenerative neurons were identified by Fluo-Jade-C staining in serial brain sections. Autophagy-lysosome was observed under electron microscope.RESULTSThe main risk factor in the development of diabetic encephalopathy was hyperglucemia, which increased the Fluo-Jade-C positive neurons in the cerebral cortex of diabetic rats. The content of malondialdehyde was increased and glutathione was decreased in diabetic rats compared with the control animals. The activity of AMPK was lower in diabetic brain than that in normal brain. Aggregated autophagysome and mitochondria enveloped by autophagy-lysosome were observed in pyramidal cells of cerebral cortex in diabetic rats.CONCLUSIONPersistent hyperglycemia and mitochondrial dysfunction contribute to the diabetic encephalopathy at an early stage in type 1 diabetes, indicating that the mechanism may be partly related to the oxidative stress and activation of autophagy.

Hyperglycemia; Mitochondria; Autophagy; Brain

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.007