14-3-3γ對燒傷及LPS誘導所致大鼠心肌損傷的保護作用*

劉 丹， 尹 東， 嚴廣華， 孫 惦， 許 旻， 何 明△

(南昌大學 1醫(yī)學院，2第二附屬醫(yī)院江西省分子醫(yī)學重點實驗室，江西 南昌330006)

1000-4718(2012)07-1160-06

2012-02-16

2012-05-03

國家自然科學基金資助項目(No.30460048;No.81072632;No.81160402;No.81100104)；博士后基金資助項目(No.20110491496)

△通訊作者 Tel: 0791-86362231；E-mail: jxhm56@163.com

▲并列第1作者

14-3-3γ對燒傷及LPS誘導所致大鼠心肌損傷的保護作用*

劉 丹1▲， 尹 東2▲， 嚴廣華1， 孫 惦1， 許 旻1， 何 明1△

(南昌大學1醫(yī)學院，2第二附屬醫(yī)院江西省分子醫(yī)學重點實驗室，江西 南昌330006)

目的研究14-3-3γ在燒傷及脂多糖(LPS)引起的心肌損傷中的保護作用。方法體內實驗建立大鼠燒傷及LPS損傷模型，檢測3、6、12、24 h各時點心功能及心肌細胞14-3-3γ蛋白表達水平的改變；體外實驗采用新生大鼠心肌細胞，構建pFLAG-14-3-3γ質粒，于LPS損傷前24 h轉染至心肌細胞，實驗結束后檢測培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH) 活性，MTT法測定細胞存活率，流式細胞術檢測細胞凋亡，線粒體腫脹實驗檢測線粒體通透性轉換孔(mPTP)開放。結果燒傷及LPS損傷模型大鼠心電圖ST段均有明顯改變，心肌細胞14-3-3γ蛋白表達水平均顯著升高。轉染了pFLAG-14-3-3γ質粒的心肌細胞能明顯對抗隨后的LPS損傷，與未轉染組比較，14-3-3γ能明顯提高細胞存活率，降低LDH活性，減少細胞凋亡，抑制mPTP的開放。結論14-3-3γ可能通過抑制mPTP的開放對燒傷及LPS所致的心肌損傷起保護作用。

14-3-3γ蛋白； 脂多糖類； 燒傷； 心??； 線粒體通透性轉換孔

大量研究證明，嚴重燒傷可引起心肌器質性損害[1]。而燒傷后的內毒素血癥是造成心肌損害的主要因素[2]。所以，研究內毒素所致心肌損傷的機制，對于預防嚴重燒傷患者因心力衰竭所致死亡有重要意義。14-3-3蛋白家族主要有7種亞型，是存在于幾乎所有生物體細胞中的一類重要蛋白質，在機體許多疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重大作用[3]。有研究表明[4]，14-3-3γ亞型在大鼠主動脈受損心肌組織中表達明顯升高，提示其有可能在提高心肌組織對損傷的反應性以及作為修復信號等方面發(fā)揮重要作用。據(jù)此，本研究擬構建大鼠嚴重燒傷模型、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)整體大鼠心臟損傷模型及大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細胞LPS損傷模型，從整體動物與細胞水平不同層次上，對14-3-3γ在內毒素所致心肌損傷中的作用及機制進行探討。

材 料 和 方 法

1藥品與主要試劑

pFLAG-CMVTM-4 質粒(Sigma)；限制性內切酶EcoR I和KpnI(NEB)；逆轉錄試劑盒、T4 DNA 連接酶、凝膠回收試劑盒及無內毒素質粒提取試劑盒購自Promega；14-3-3γ抗體、β-actin 抗體及相應Ⅱ抗(Santa Cruz)；線粒體分離試劑盒(Biovision)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；MEM培養(yǎng)基(Gibco-BRL)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；增強化學發(fā)光印跡試劑和硝酸纖維素膜(Amersham)、胰酶、MTT、HEPES、PMSF、亮肽素、丙烯酰胺、SDS、亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、 TEMED、 EDTA 和 DTT均購自Sigma；其它試劑均為分析純。

2方法

2.1體內實驗部分

2.1.1動物及分組 成年健康Wistar大鼠80只，體重(220±20)g，隨機分為2組：I組(燒傷組)，除正常對照外，其余動物脫毛后用燙傷儀制成30%體表面積III度燙傷模型；Ⅱ組(LPS處理組)，除正常對照外，其余大鼠尾靜脈注射LPS 1 mg/kg。處理后在相應時點(3、6、12、24 h)作相應檢測。

2.1.2大鼠心臟功能檢測 (1)記錄大鼠標準Ⅱ導聯(lián)心電圖，計算ST段改變(上升或下降)的頻率與數(shù)量；(2)摘眼球取血2～3 mL，室溫靜置1 h，2 000 r/min離心，取血清；用Beckman全自動生化分析儀測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸磷酸激酶(creatine phosphokinase,CPK)、肌酸磷酸激酶同工酶(CPK-MB)等心肌酶譜之活性。

2.1.3Western blotting檢測 實驗結束后，加入三去污劑裂解液裂解心肌細胞，提取總蛋白，同等量蛋白質完成SDS-PAGE后，進行電轉膜，再先后結合Ⅰ抗和Ⅱ抗，最后X線膠片曝光分析。

2.2體外實驗部分

2.2.1心肌細胞的分離培養(yǎng) 下列操作均在超凈臺內進行[5]。取出生1～3 d的SD乳鼠，開胸取出心臟，分離心室組織，經(jīng)0.1%胰酶消化分離，用含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基混懸后置CO2培養(yǎng)箱(5%CO2、37 ℃)培養(yǎng)2 h去除成纖維細胞，計算細胞懸液中臺盼藍拒染的活細胞數(shù)，達90%以上。分別按5×105cells/well和1×105cells/well接種于6孔培養(yǎng)板和96孔培養(yǎng)板內，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，前3 d加入終濃度為0.1mmol·L-1Brdu抑制纖維細胞生長，培養(yǎng)4 d隨機分組進行實驗。

2.2.214-3-3γ真核表達載體pFLAG-14-3-3γ的構建 取大鼠心肌組織50 mg，用RT-PCR方法獲取14-3-3γ(GenBank D17447.1)的全長編碼cDAN，上游引物5'-AAGAATTCCCCCGCGAAGATG-3'，下游引物5'-TTAGGTACCTGGGGCCTTAGTTGTT-3'，分別在上、下游引物中引入EcoR I和KpnI的酶切位點及保護性堿基。PCR擴增后的目的基因cDNA與質粒pFLAG- CMVTM-4用EcoR I和KpnI雙酶切、T4連接酶連接。連接反應產物轉化感受態(tài)細胞并用抗生素篩選。質粒提取后，行酶切鑒定和DNA測序。

2.2.3pFLAG-14-3-3γ重組質粒轉染及表達效率的檢測 在轉染前，PBS洗2次，除去抗生素，將LipofectamineTM2000 (μL) 與DNA (μL) 以2.0∶ 0.8 的比例混合，加入到每孔細胞中去，置于培養(yǎng)箱(5% CO2、95%空氣、37 ℃)中孵育。24 h 后，裂解細胞，提取蛋白，Western blotting檢測心肌細胞14-3-3γ蛋白表達，以空載質粒載體pFLAG為對照。

2.2.4實驗分組 (1)正常對照組；(2)LPS組：加LPS至培養(yǎng)液中，終濃度為10 mg/L，孵育6 h；(3)pFLAG+LPS組：空載質粒pFLAG轉染至心肌細胞中，24 h后處理同LPS組；(4)pFLAG-14-3-3γ+LPS組：重組質粒pFLAG-14-3-3γ轉染至心肌細胞中，24 h后處理同LPS組。

2.2.5細胞存活率檢測 采用MTT比色法檢測。胰酶消化后收集細胞，每組細胞以1×104cells/well濃度接種于96孔培養(yǎng)板中。細胞覆蓋率達70%～80% 后吸出培養(yǎng)基。每孔加入MTT溶液(5 g·L-1溶于PBS)20 μL，37 ℃孵育4 h。小心地吸棄孔內培養(yǎng)上清液，再每孔加DMSO 150 μL振蕩10 min，使藍色結晶充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其吸光度(A)，以間接反映各組活細胞數(shù)量。

2.2.6生化檢測 實驗結束后各組分別取孵育液200 μL，Beckman生化自動分析儀測定LDH活性。

2.2.7細胞凋亡檢測 各級處理結束后，收集細胞，在細胞懸液中加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，再加入300 μL binding buffer，立即進行流式細胞術檢測。

2.2.8線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放檢測 按試劑盒說明分離心肌細胞線粒體，通過線粒體腫脹實驗檢測mPTP 的開放。520 nm波長測各組吸光度初值(A1)，加200 μmol·L-1CaCl2誘導mPTP 開放，20 min 后吸光度不再變化，記錄此時吸光度值(A2)，ΔA=A1-A2。用ΔA/min×103表示mPTP 開放程度。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1體內實驗部分

1.1燒傷及LPS處理后各時點心電圖改變 如表1所示，燒傷組(Ⅰ)及LPS組(Ⅱ)大鼠心電圖ST段改變隨致傷時間的延長而愈加明顯，其中燒傷組從12 h開始 ST段改變明顯(P<0.05)，LPS組從6 h開始ST段改變明顯(P<0.05)。

表1燒傷及LPS處理對大鼠心電圖ST段改變的影響

GroupIncidenceNSTBurnLPSBurnLPSControl----3h17.5±3.211.2±2.036±716±56h18.2±2.717.6±2.5*38±929±9*12h30.4±3.3*21.7±2.8*55±11*34±10**24h33.6±3.5*24.5±3.1**59±13*37±8**

*P<0.05,**P<0.01vs3 h. NST: non-stress test.

1.2燒傷及LPS處理后各時點生化指標改變 燒傷組(Ⅰ)及LPS組(Ⅱ)的LDH、CPK和CPK-MB在致傷后3 h均明顯升高(P<0.01)，致傷后6 h基本達到峰值，并持續(xù)到24 h，見圖1。

1.3燒傷及LPS處理后各時點14-3-3γ蛋白改變 燒傷后，心肌14-3-3γ蛋白表達在24 h才出現(xiàn)明顯的升高(P<0.01)，而LPS處理后，心肌14-3-3γ蛋白表達在6 h即出現(xiàn)明顯升高(P<0.01)，并持續(xù)至24 h，見圖2。

圖1燒傷及LPS處理后大鼠各時點血清LDH、CPK和CPK-MB活性的改變

2體外實驗部分

2.1培養(yǎng)心肌細胞的一般特性 分離培養(yǎng)的心肌細胞在培養(yǎng)4～6 h后開始貼壁生長，伸出偽足，形態(tài)由圓形變?yōu)樗笮?、三角形或星形?4 h后細胞基本貼壁，少數(shù)單個細胞呈現(xiàn)不同頻率的自發(fā)性搏動(60～80 min-1)；72 h后細胞伸出偽足相互交織成網(wǎng)狀，逐漸形成細胞簇，搏動成同步性，收縮有力(90～110 min-1)。

2.2轉染pFLAG-14-3-3γ至心肌細胞的蛋白表達 Western blotting結果顯示，轉染了空載質粒pFLAG 組14-3-3γ蛋白表達與正常組相比無改變，而轉染了重組質粒的pFLAG-14-3-3γ組，14-3-3γ蛋白表達則明顯增加(P<0.01)。此結果說明重組的14-3-3γ真核表達載體在原代乳鼠心肌細胞中能有效表達，見圖3。

圖2Westernblotting檢測燒傷及LPS處理后各時點心肌細胞14-3-3γ蛋白表達水平的變化

圖3Westernblotting檢測轉染pFLAG-14-3-3γ至心肌細胞后14-3-3γ蛋白的表達

2.314-3-3γ基因轉染對LPS損傷后細胞存活率、LDH的影響 LPS組與對照組比較細胞存活率明顯降低，LDH活性升高(P<0.01)； 而轉染了pFLAG-14-3-3γ的心肌細胞，則能明顯對抗隨后LPS所致?lián)p傷，使細胞存活率明顯升高、LDH降低(P<0.01)，見表2。

表214-3-3γ基因轉染對LPS損傷后細胞存活率和LDH釋放的影響

GroupViability(%)LDH(U·L-1)Control94.5±7.33.22±0.49LPS27.8±4.3**34.26±5.31**pFLAG+LPS24.3±4.9**36.28±4.39**pFLAG-14-3-3γ+LPS67.5±6.2##15.63±2.41##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS.

2.414-3-3γ基因轉染對LPS損傷后細胞凋亡的影響 LPS處理使細胞凋亡達到(32.5±4.2)%，與對照組相比明顯升高(P<0.01)，而轉染了pFLAG-14-3-3γ的細胞再遭受LPS損傷處理，則細胞凋亡降至(17.3±2.1)%(P<0.01)，見圖4。

2.514-3-3γ基因轉染對LPS損傷后mPTP開放的影響 mPTP 開放時，線粒體通透性增大，導致線粒體腫脹，吸光度下降。LPS組ΔA/min值較對照組明顯升高(P<0.01)，提示LPS處理能使mPTP開放，線粒體通透性增加。轉染pFLAG-14-3-3γ能明顯阻止LPS所致的mPTP開放，使ΔA/min值明顯下降(P<0.01),見圖5。

圖4轉染14-3-3γ基因對LPS損傷后心肌細胞凋亡的影響

圖5轉染14-3-3γ基因對LPS損傷后mPTP開放的影響

討 論

眾所周知，機體遭受嚴重燒傷后，腸道細菌移位以及創(chuàng)面外源性感染，大量細菌毒素入血，導致休克，甚至多器官功能衰竭，而心臟則是主要毒性靶位之一[6]。我們在體外實驗中建立大鼠燒傷模型及LPS損傷模型，結果顯示在致傷后3～24 h均有不同程度ST段改變，且隨著致傷時間的延長而更為明顯； LDH、CPK、CPK-MB等心肌酶譜在致傷后3 h即明顯升高，致傷后6 h基本達到峰值，并持續(xù)到24 h。這一結果表明，燒傷組及LPS組大鼠心臟確實均存在著嚴重急性損傷。尋找內源性保護性蛋白是本研究的重點。

14-3-3蛋白是一個細胞內磷酸化結合調節(jié)分子，其通過與許多信號蛋白結合，調節(jié)幾乎所有重要的信號轉導、凋亡、細胞周期通道[7-8]。近年來大量研究證實14-3-3蛋白在許多疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中，可能發(fā)揮十分重要的作用。有研究指出，球囊擴張術后，大鼠頸動脈平滑肌細胞與心肌細胞內14-3-3γ亞型蛋白表達上調[4]；原代培養(yǎng)的膠質細胞急性缺氧/復氧損傷也使得14-3-3γ亞型蛋白表達增加[9]，這些研究結果均說明14-3-3γ可能在急性損傷時，對于提高組織對損傷的反應性以及作為修復信號等方面發(fā)揮重要作用。為此，我們在體外實驗中檢測14-3-3γ蛋白表達水平的改變，結果表明，在燒傷及LPS處理后，隨著時間的延長14-3-3γ表達開始升高，提示14-3-3γ作為一個內源性蛋白的表達升高，可能參與了機體對抗燒傷所致內毒素血癥對心肌的急性損傷。

為了進一步研究14-3-3γ在心肌遭受內毒素急性損傷過程中所起的作用，我們構建了pFLAG-14-3-3γ重組質粒，將其轉染至原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中，結果表明轉染了pFLAG-14-3-3γ的心肌細胞，對隨后的LPS急性損傷能起到明顯的對抗作用，并且這種對抗作用是通過減少mPTP的開放來完成的。mPTP是線粒體跨膜多蛋白復合物孔，在某些因素的刺激下，mPTP開放，當其長時間開放，會導致線粒體外膜的破裂，分布在膜間的前凋亡分子釋放，包括細胞色素C、第2種源自線粒體的胱冬酶激活蛋白/具有低等電點的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)結合蛋白(second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pI, Smac/Diab-LO)、凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor, AIF)、核酸內切酶G(Endo G)和Htra2/Omi。這些分子通過半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases，細胞內與凋亡有關的蛋白酶)依賴機制和非caspase依賴(例如AIF)機制導致細胞死亡[10-11]。那么，14-3-3γ是通過何種機制抑制mPTP的開放，從而對急性的心肌細胞產生保護作用，將是我們進一步研究的重點。

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Protectiveroleof14-3-3γinburnandLPS-inducedratmyocardialinjury

LIU Dan1, YIN Dong2, YAN Guang-hua1, SUN Dian1, XU Min1, HE Ming1

(1MedicalCollege,2JiangxiProvincialKeyLaboratoryofMolecularMedicine,theSecondAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:jxhm56@163.com)

AIM: To study the protective role of 14-3-3γ in burn or LPS-induced myocardial injury.METHODSThe rat model of burn or LPS-induced injury was established. The heart functions and 14-3-3γ protein expression were detected 3 h, 6 h, 12 h and 24 h after treatment. Primary neonatal rat cardiomyocytes were usedinvitro. pFLAG-14-3-3γ plasmid was constructed and transfected into the cardiomyocytes 24 h before LPS-induced injury. The injury in the cardiomyocytes was evaluated by measuring the cell viability and the level of lactate dehydrogenase(LDH). Apoptosis of cardiomyocytes was detected by flow cytometry. Opening of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) was also determined by Ca2+-induced swelling of isolated myocardial mitochondria.RESULTSThe expression of 14-3-3γ was elevated following the burn or LPS-induced myocardial injuryinvivo.Invitro, transfection with pFLAG-14-3-3γ plasmid in to the cardiomyocytes significantly protected against LPS-induced injury. Compared with the cardiomyocytes without transfection with pFLAG-14-3-3γ plasmid, higher cell viability rate and lower LDH release, cell apoptosis and mPTP opening were observed in the cardiomyocytes transfected with pFLAG-14-3-3γ plasmid.CONCLUSIONThe 14-3-3γ protein protects the heart against burn or LPS-induced injury by inhibiting the mPTP opening.

14-3-3γ protein; Lipopolysaccharides; Burns; Myocardium; Mitochondrial permeability transition pore

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.002