陳海江 丁杰鋒
產(chǎn)前檢測IgG抗A(B)血型效價是預測和判斷ABO血型不合新生兒溶血病(haemolytic disease of the newborn,HDN)的主要依據(jù),并且HDN癥狀隨著母體IgG抗A(B)血型效價水平的提高而遞增[1]。目前實際應用中醫(yī)院主要采用微柱凝膠抗人球蛋白試驗法(microcolumn gelCoombstest,MG - Coombs'T)檢測IgG抗A(B)效價。此法沒有全國統(tǒng)一操作標準,各個醫(yī)院有不同的實驗方法。不同的實驗方法會導致不同的結(jié)果,無法進行相互比較,而且如果實驗操作步驟設(shè)計不合理、不科學會導致結(jié)果失真和較低重復性,因此對實驗操作方法進行優(yōu)化是保證結(jié)果準確性和重復性的重要前提。本文采用微量板倍量稀釋法進行稀釋,從比較裂解液(2-Me、DTT)類型與稀釋比例、裂解液處理時間和細胞溫浴時間差異對結(jié)果的影響,綜合得出最佳操作方案,將此方案與試管倍量稀釋法進行比較,判斷改進后的效果[2]。
1.標本來源:2011年7~8月來筆者醫(yī)院進行產(chǎn)前檢查的O型孕婦110例,其中進行IgG抗A測定47例,進行IgG抗B測定49例,進行IgG抗AB測定14例。孕婦年齡在22~29周歲之間,孕周在12~38周之間。
2.試劑和儀器:0.2mol/L 2巰基乙醇(2-Me)、MG -Coombs'試劑卡、37℃恒溫孵育箱、卡式離心機由長春博迅(Bioxun)生物技術(shù)有限公司提供;0.2mol/L二硫蘇糖醇(DTT)自配,二硫蘇糖醇由加拿大SIGMA-Aidrich公司生產(chǎn)。96孔酶標板。0.8%的紅細胞懸液自配。
3.方法:(1)對實驗條件進行優(yōu)化,選取兩個標本:一個效價高值,一個低值,兩例均為IgG抗AB檢測。每次操作均將此2例標本重復測定3次,取平均值。①比較裂解液(2-Me、DTT)類型與稀釋比例對結(jié)果影響。按下表1設(shè)置以下4組。將此2例孕婦標本加到酶標板每行第1孔,均按每組設(shè)置的裂解液類型和稀釋比例進行處理,在37℃恒溫孵育箱溫浴1h。取出后在酶標板每行后面幾孔進行倍比稀釋。每孔起加0.8×10-2mol/L的AB型紅細胞懸液。置37℃恒溫孵育箱孵育30min,后吸取至微柱卡置卡式離心機離心。以2+凝集為判定終點;②比較裂解液處理時間差異對結(jié)果的影響。裂解液類型及量稀釋方案取表1第3組,即300μl DTT加100μl血清,在37℃恒溫孵育箱溫浴處理時間分為 15min、30min、60min、120min 4組,其他操作步驟同前;③比較細胞溫浴時間差異。裂解液類型及量稀釋方案取表1第3組,即300μl DTT加100μl血清,將細胞溫浴時間分為 15min,30min,60min 3組,其他操作步驟同前。(2)對以上3步進行綜合分析并改進,得出最佳操作方案,將此方案用微量板倍量稀釋法對110例孕婦血清標本測定,同時再用試管倍量稀釋法重新測定,得出兩組結(jié)果,比較差異[2]。
表1 裂解液類型及量稀釋血清情況
1.不同的實驗條件對結(jié)果的影響及最佳實驗方案:(1)裂解液(2-Me、DTT)類型與稀釋比例對結(jié)果影響情況:從圖1可看出,DTT與血清比例為1∶1時,對結(jié)果有些影響,而當DTT與血清比例為3∶1、7∶1時結(jié)果與2-Me與血清比例1∶1相同。實驗結(jié)果顯示DTT與血清比例最好為3∶1。(2)裂解液不同處理時間對結(jié)果的影響情況:從圖2可以看出處理時間太短,對低值標本結(jié)果影響較大,易使其結(jié)果偏高;處理時間太長會導致高值標本結(jié)果降低。筆者取裂解液最佳處理時間為60min。(3)細胞溫浴時間差異對結(jié)果影響情況:從圖3可以看出,溫浴時間較短對高值結(jié)果有一定影響,筆者取最佳溫浴時間為30min。(4)實驗操作改進后的最佳方案:取DTT與血清比例為3∶1,37℃ 處理時間為 60min,細胞溫浴時間為30min。
圖1 不同裂解液(2-Me、DTT)、不同稀釋比例與結(jié)果關(guān)系
2.改進后的方法與試管倍量稀釋法進行測定:110例孕婦標本,得出結(jié)果比較見表2。由表2可以得出,改進后的操作方法與試管倍量稀釋法比較結(jié)果差異在統(tǒng)計學上無顯著意義(P>0.05)。
表2 改進方法與試管倍量稀釋法效價結(jié)果比較(x±s)
產(chǎn)前孕婦IgG檢測在國內(nèi)開展已有10余年的歷史。最為經(jīng)典的是試管倍量稀釋法,由于其操作繁瑣,耗時長,人力勞動投入多,重復性較低,只適合少量標本檢測。在具有大批量標本檢測的實驗室里基本摒棄不用,而主要采用微量板倍量稀釋法。免疫微量板易得,價格低廉,可以代替試管進行稀釋,運用8通道排槍可以進行倍比稀釋,能節(jié)約很多時間,并且提高了準確性和重復性,這是其得到了大量應用的主要原因。但是目前對于微量板倍量稀釋法操作沒有統(tǒng)一的標準。
由于目前檢測效價都是采用手工方法,在檢測過程中容易受到各種實驗條件和人的主觀干擾。裂解液經(jīng)典方法推薦使用2巰基乙醇(2-Me),但是由于其具有惡臭味,氣味較濃,對人體損害較大,很多實驗者采用二硫蘇糖醇(DTT)。其氣味很淡,反應快速,易于被接受,但對IgM的裂解能力較差[3]。從圖1、圖2中可以看出,DTT裂解液比例較低、處理時間較短容易致IgM破壞不完全,尤其是低值標本,結(jié)果易表現(xiàn)為IgM型,而且開始稀釋比例較低,會增加稀釋個數(shù),使手工操作的誤差加大,影響實驗結(jié)果,如圖1第2組高值標本;相反,如果DTT裂解液比例過大、處理時間過長的話容易導致蛋白變性,對IgG破壞較大,使檢測結(jié)果偏低,尤其是高值標本,更易致結(jié)果不準,而且一開始比例過大使試劑消耗太多。所以筆者認為DTT與血清比例為3∶1、37℃處理60min是科學、有效、適宜的。對于細胞溫浴時間筆者認為30min足夠了,時間太短容易使IgG與紅細胞結(jié)合不完全,容易使結(jié)果偏低;時間太長容易導致細胞變性影響結(jié)果觀察,而且會使實驗操作過程延長,降低了效率。因此,我們得出了改進后的最佳操作方案:DTT與血清比例為3∶1、37℃處理60min、細胞溫浴時間為30min。此方案用微量板倍量稀釋法與試管倍量稀釋法比較結(jié)果差別很小,可替代試管倍量稀釋法。
本研究從操作過程中的幾個重要步驟進行優(yōu)化,得出了最佳的操作方案。在最后一步檢測時,大多數(shù)實驗室采用微柱凝膠卡法。有研究證實比傳統(tǒng)試管法操作更簡便、快捷,應用于孕婦產(chǎn)前效價檢測有更高的靈敏度,而且在應用過程中感受到此卡結(jié)果易于判斷和保存,能極大地減少了主觀誤差。因此改進后的方法是準確、有效的,更適合實驗室進行大批量標本檢測[4]。
1 Hadley AG.Laboratory assays for predicting the severity of haemolytic disease of the fetus and newborn [J].Transpl Immunol,2002,10(2):191-198
2 夏琳.臨床輸血診療技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:101-102
3 孫桂香,張曉娟.唾液、DTT、2-Me三種物質(zhì)對IgM抗體中和能力的比較[J].科學與技術(shù)工程,2007,7(8):1723 -1724
4 李凌波,王冬倩,陳云聲,等.國產(chǎn)微柱凝膠免疫檢測試劑卡檢測孕婦IgG血型抗體效價的實驗研究[J].中國免疫學雜志,2008,24:1138-1140