微量板倍量稀釋法檢測IgG抗A(B)效價改進研究

陳海江 丁杰鋒

產(chǎn)前檢測IgG抗A(B)血型效價是預測和判斷ABO血型不合新生兒溶血病(haemolytic disease of the newborn，HDN)的主要依據(jù)，并且HDN癥狀隨著母體IgG抗A(B)血型效價水平的提高而遞增［1］。目前實際應用中醫(yī)院主要采用微柱凝膠抗人球蛋白試驗法(microcolumn gelCoombstest，MG － Coombs'T)檢測IgG抗A(B)效價。此法沒有全國統(tǒng)一操作標準，各個醫(yī)院有不同的實驗方法。不同的實驗方法會導致不同的結(jié)果，無法進行相互比較，而且如果實驗操作步驟設(shè)計不合理、不科學會導致結(jié)果失真和較低重復性，因此對實驗操作方法進行優(yōu)化是保證結(jié)果準確性和重復性的重要前提。本文采用微量板倍量稀釋法進行稀釋，從比較裂解液(2－Me、DTT)類型與稀釋比例、裂解液處理時間和細胞溫浴時間差異對結(jié)果的影響，綜合得出最佳操作方案，將此方案與試管倍量稀釋法進行比較，判斷改進后的效果［2］。

材料與方法

1．標本來源:2011年7～8月來筆者醫(yī)院進行產(chǎn)前檢查的O型孕婦110例，其中進行IgG抗A測定47例，進行IgG抗B測定49例，進行IgG抗AB測定14例。孕婦年齡在22～29周歲之間，孕周在12～38周之間。

2．試劑和儀器:0．2mol/L 2巰基乙醇(2－Me)、MG －Coombs'試劑卡、37℃恒溫孵育箱、卡式離心機由長春博迅(Bioxun)生物技術(shù)有限公司提供;0．2mol/L二硫蘇糖醇(DTT)自配，二硫蘇糖醇由加拿大SIGMA－Aidrich公司生產(chǎn)。96孔酶標板。0．8%的紅細胞懸液自配。

3．方法:(1)對實驗條件進行優(yōu)化，選取兩個標本:一個效價高值，一個低值，兩例均為IgG抗AB檢測。每次操作均將此2例標本重復測定3次，取平均值。①比較裂解液(2－Me、DTT)類型與稀釋比例對結(jié)果影響。按下表1設(shè)置以下4組。將此2例孕婦標本加到酶標板每行第1孔，均按每組設(shè)置的裂解液類型和稀釋比例進行處理，在37℃恒溫孵育箱溫浴1h。取出后在酶標板每行后面幾孔進行倍比稀釋。每孔起加0．8×10－2mol/L的AB型紅細胞懸液。置37℃恒溫孵育箱孵育30min，后吸取至微柱卡置卡式離心機離心。以2+凝集為判定終點;②比較裂解液處理時間差異對結(jié)果的影響。裂解液類型及量稀釋方案取表1第3組，即300μl DTT加100μl血清，在37℃恒溫孵育箱溫浴處理時間分為 15min、30min、60min、120min 4組，其他操作步驟同前;③比較細胞溫浴時間差異。裂解液類型及量稀釋方案取表1第3組，即300μl DTT加100μl血清，將細胞溫浴時間分為 15min，30min，60min 3組，其他操作步驟同前。(2)對以上3步進行綜合分析并改進，得出最佳操作方案，將此方案用微量板倍量稀釋法對110例孕婦血清標本測定，同時再用試管倍量稀釋法重新測定，得出兩組結(jié)果，比較差異［2］。

表1 裂解液類型及量稀釋血清情況

結(jié) 果

1．不同的實驗條件對結(jié)果的影響及最佳實驗方案:(1)裂解液(2－Me、DTT)類型與稀釋比例對結(jié)果影響情況:從圖1可看出，DTT與血清比例為1∶1時，對結(jié)果有些影響，而當DTT與血清比例為3∶1、7∶1時結(jié)果與2－Me與血清比例1∶1相同。實驗結(jié)果顯示DTT與血清比例最好為3∶1。(2)裂解液不同處理時間對結(jié)果的影響情況:從圖2可以看出處理時間太短，對低值標本結(jié)果影響較大，易使其結(jié)果偏高;處理時間太長會導致高值標本結(jié)果降低。筆者取裂解液最佳處理時間為60min。(3)細胞溫浴時間差異對結(jié)果影響情況:從圖3可以看出，溫浴時間較短對高值結(jié)果有一定影響，筆者取最佳溫浴時間為30min。(4)實驗操作改進后的最佳方案:取DTT與血清比例為3∶1，37℃ 處理時間為 60min，細胞溫浴時間為30min。

圖1 不同裂解液(2－Me、DTT)、不同稀釋比例與結(jié)果關(guān)系

2．改進后的方法與試管倍量稀釋法進行測定:110例孕婦標本，得出結(jié)果比較見表2。由表2可以得出，改進后的操作方法與試管倍量稀釋法比較結(jié)果差異在統(tǒng)計學上無顯著意義(P＞0．05)。

表2 改進方法與試管倍量稀釋法效價結(jié)果比較(x±s)

討 論

產(chǎn)前孕婦IgG檢測在國內(nèi)開展已有10余年的歷史。最為經(jīng)典的是試管倍量稀釋法，由于其操作繁瑣，耗時長，人力勞動投入多，重復性較低，只適合少量標本檢測。在具有大批量標本檢測的實驗室里基本摒棄不用，而主要采用微量板倍量稀釋法。免疫微量板易得，價格低廉，可以代替試管進行稀釋，運用8通道排槍可以進行倍比稀釋，能節(jié)約很多時間，并且提高了準確性和重復性，這是其得到了大量應用的主要原因。但是目前對于微量板倍量稀釋法操作沒有統(tǒng)一的標準。

由于目前檢測效價都是采用手工方法，在檢測過程中容易受到各種實驗條件和人的主觀干擾。裂解液經(jīng)典方法推薦使用2巰基乙醇(2－Me)，但是由于其具有惡臭味，氣味較濃，對人體損害較大，很多實驗者采用二硫蘇糖醇(DTT)。其氣味很淡，反應快速，易于被接受，但對IgM的裂解能力較差［3］。從圖1、圖2中可以看出，DTT裂解液比例較低、處理時間較短容易致IgM破壞不完全，尤其是低值標本，結(jié)果易表現(xiàn)為IgM型，而且開始稀釋比例較低，會增加稀釋個數(shù)，使手工操作的誤差加大，影響實驗結(jié)果，如圖1第2組高值標本;相反，如果DTT裂解液比例過大、處理時間過長的話容易導致蛋白變性，對IgG破壞較大，使檢測結(jié)果偏低，尤其是高值標本，更易致結(jié)果不準，而且一開始比例過大使試劑消耗太多。所以筆者認為DTT與血清比例為3∶1、37℃處理60min是科學、有效、適宜的。對于細胞溫浴時間筆者認為30min足夠了，時間太短容易使IgG與紅細胞結(jié)合不完全，容易使結(jié)果偏低;時間太長容易導致細胞變性影響結(jié)果觀察，而且會使實驗操作過程延長，降低了效率。因此，我們得出了改進后的最佳操作方案:DTT與血清比例為3∶1、37℃處理60min、細胞溫浴時間為30min。此方案用微量板倍量稀釋法與試管倍量稀釋法比較結(jié)果差別很小，可替代試管倍量稀釋法。

本研究從操作過程中的幾個重要步驟進行優(yōu)化，得出了最佳的操作方案。在最后一步檢測時，大多數(shù)實驗室采用微柱凝膠卡法。有研究證實比傳統(tǒng)試管法操作更簡便、快捷，應用于孕婦產(chǎn)前效價檢測有更高的靈敏度，而且在應用過程中感受到此卡結(jié)果易于判斷和保存，能極大地減少了主觀誤差。因此改進后的方法是準確、有效的，更適合實驗室進行大批量標本檢測［4］。

1 Hadley AG．Laboratory assays for predicting the severity of haemolytic disease of the fetus and newborn ［J］．Transpl Immunol，2002，10(2):191－198

2 夏琳．臨床輸血診療技術(shù)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:101－102

3 孫桂香，張曉娟．唾液、DTT、2－Me三種物質(zhì)對IgM抗體中和能力的比較［J］．科學與技術(shù)工程，2007，7(8):1723 －1724

4 李凌波，王冬倩，陳云聲，等．國產(chǎn)微柱凝膠免疫檢測試劑卡檢測孕婦IgG血型抗體效價的實驗研究［J］．中國免疫學雜志，2008，24:1138－1140