HPLC測定不同熱處理方式對鏡鯉魚中呈味核苷酸的影響

曹 偉，許曉曦

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

HPLC測定不同熱處理方式對鏡鯉魚中呈味核苷酸的影響

曹 偉，許曉曦*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

采用高效液相色譜法（HPLC）測定了鏡鯉魚的生鮮、煮制、蒸制，三種處理方式的魚肉中的呈味核苷酸的含量。色譜柱為Ultimate AQ-C18（4.6×250mm，5μm），流動相為：A為甲醇溶液，B為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH4.1），等度洗脫，流速1mL/min，檢測波長為260nm，柱溫為30℃。結(jié)果表明：5種呈味核苷酸分離較好，5’-CMP、5’-GMP和5’-IMP含量在煮制和蒸制條件下與生鮮魚肉存在顯著差異，而煮制和蒸制熱處理鏡鯉魚中這兩種核苷酸沒有顯著差異。其中5’-UMP在生鮮魚肉中被檢出，在煮制和蒸制條件下未檢出，5’-AMP在三種條件下均未被檢出。

高效液相色譜，鏡鯉魚，呈味核苷酸

在新鮮的肉制品及水產(chǎn)品中，5’-腺苷酸二鈉（AMP）、5’-胞苷酸二鈉（CMP）、5’-肌苷酸二鈉（IMP）、5’-鳥苷酸二鈉（GMP）和5’-尿苷酸二鈉（UMP），這些核苷酸類化合物起到強(qiáng)烈的呈鮮味作用[1-2]，也決定著肉制品的口感、風(fēng)味及鮮度。呈味核苷酸類化合物質(zhì)在水產(chǎn)品中含量豐富，不僅具有顯著的增鮮作用，而且對于水產(chǎn)品的各種滋味具一定的增減作用。近年來，人們對食品的鮮味進(jìn)行了廣泛的研究，鮮味與甜味、苦味、酸味、咸味一樣同屬于基本味，是食品的一種重要風(fēng)味。故測定水產(chǎn)品及肉類食品中核苷酸含量對研究肉類食品風(fēng)味及呈味物質(zhì)之間的相互關(guān)系有著重要意義。目前，國內(nèi)外對不同肉類如豬肉、雞肉、蟹肉等核苷酸含量變化進(jìn)行了大量研究[3-5]，而對鏡鯉魚中呈味核苷酸研究相對較少。本實驗采用高效液相色譜法對不同熱處理方法下鏡鯉魚中呈味核苷酸進(jìn)行分離測定，建立測定水產(chǎn)品中呈味核苷酸簡便、準(zhǔn)確的方法，并對不同熱處理方法對呈味核苷酸數(shù)量影響進(jìn)行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鏡鯉魚 市售；5’-AMP、5’-CMP、5’-IMP、5’-GMP、5’-UMP（標(biāo)準(zhǔn)品） Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；磷酸二氫鉀（分析純） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；磷酸（分析純） 天津市天麗化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸（分析純） 天津市天大化學(xué)試劑廠。

HP1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LD4-2A型臺式離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 分別準(zhǔn)確稱取5種標(biāo)準(zhǔn)品60mg，用水溶解置于100mL容量瓶中并定容至刻度。此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.6mg/mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時使用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，標(biāo)準(zhǔn)溶液及流動相必須當(dāng)天配制。

1.2.2 樣品處理 實驗樣品魚經(jīng)屠宰去骨后，準(zhǔn)確稱取背部肌肉10g，做為對照組。再準(zhǔn)確稱取10g在100℃下用水煮熟10min。最后準(zhǔn)確稱取10g在100℃下用水蒸熟10min。測定時，將魚肉剪碎放入勻漿器內(nèi)，加入20mL 5%的TCA（三氯乙酸）溶液打漿2min，超聲波處理5min，然后4000r/min離心5min。取上清液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，得到的沉淀物用5%TCA溶液再進(jìn)行浸提、超聲處理、離心等操作兩次，合并上清液定容。使用前用針管和0.45μm精密濾膜過濾到進(jìn)樣瓶。

1.2.3 HPLC工作條件 色譜柱：Ultimate AQ-C18（4.6× 250mm，5μm），檢測器：紫外檢測器，檢測波長：260nm，柱溫：30℃。流動相：A為甲醇溶液，B為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH至4.1），等度洗脫，流速1mL/min。進(jìn)樣前用甲醇沖洗色譜柱30min，之后用流動相平衡色譜柱30min，至基線平穩(wěn)。進(jìn)樣量5μL，測定三次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果

配制一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用1.2.3中色譜工作條件，得到5種呈味核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品HPLC圖譜。見圖1。

由圖1可以看出在紫外檢測器在260nm，柱溫為30℃時，以甲醇和0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液混合做為流動相時，在等度洗脫條件下，可以使各呈味核苷酸很好的分離，無雜質(zhì)峰、無色譜峰拖尾及分離不完全現(xiàn)象。

圖1 呈味核苷酸標(biāo)準(zhǔn)HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of standard saporous nucleotides

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 各呈味核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equations，correlation coefficients and detection limits of five flavor nucleotides

將配制好的一系列不同濃度的呈味核苷酸標(biāo)準(zhǔn)樣品混合溶液分析其含量，以混合溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)作圖。得到各呈味核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)見表1，由表1可見標(biāo)準(zhǔn)圖譜的峰面積與呈味核苷酸溶液濃度具有良好的相關(guān)性。

2.3 鏡鯉魚中呈味核苷酸的測定

根據(jù)實驗方法1.2對鏡鯉魚背部肌肉的呈味核苷酸進(jìn)行了提取和檢測，得到鏡鯉魚HPLC圖譜，見圖2~圖4。

圖2 鏡鯉魚生鮮肉中呈味核苷酸的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of five flavor nucleotides mirror carp raw meat

圖3 鏡鯉魚煮熟肉中呈味核苷酸的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of five flavor nucleotides mirror carp cooked meat

圖4 鏡鯉魚蒸熟肉中呈味核苷酸的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of five flavor nucleotides mirror carp steamed meat

以上HPLC圖譜經(jīng)安捷倫化學(xué)工作站分析比較，得到鏡鯉魚中呈味核苷酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 鏡鯉魚中各種呈味核苷酸含量Table 2 Mirror carp flavor nucleotides content

由表2可知，生鮮魚肉與煮熟魚肉和蒸熟魚肉中核苷酸物質(zhì)含量差異顯著（p<0.05），煮熟后，5’-CMP、5’-GMP、5’-IMP含量降低顯著（p<0.05），而蒸熟后5’-CMP、5’-GMP、5’-IMP和生鮮魚肉比較，含量降低更加明顯。5’-UMP只在生鮮魚肉中被檢出，在煮制和蒸制過程中未被檢出。在檢測過程中5’-AMP在三種加工過程中均未被檢測出來，這可能與水產(chǎn)品中5’-AMP含量極少有關(guān)。

加熱導(dǎo)致鏡鯉魚肉中核苷酸類物質(zhì)的變化主要來自于加熱過程汁液的流失和核苷酸類物質(zhì)自身熱降解[6]，C.O.Mohan等[7]在對加熱后魚肉中核苷酸類物質(zhì)的變化研究，發(fā)現(xiàn)與本實驗相一致的變化趨勢。5’-IMP在受熱過程容易降解[8]，并且熱穩(wěn)定性較差。研究表明，豬肉[9]和蘑菇[10]等食品中，5’-IMP含量在加熱過程中也會大幅降低。

呈味強(qiáng)度值（taste activity value，TAV），是指呈味物質(zhì)在樣品中的含量與該化合物的味道閾值之比。考察物質(zhì)對滋味的貢獻(xiàn)大小不是取決于呈味核苷酸含量的高低，而是取決于其TAV。如果某物質(zhì)的TAV大于1，則說明該物質(zhì)對滋味有重要貢獻(xiàn)。鏡鯉魚中呈味核苷酸的呈味強(qiáng)度值見表3。

表3 鏡鯉魚中呈味核苷酸的呈味強(qiáng)度值Table 3 Mirror carp flavor nucleotides TAV

由表3可見，生鮮魚肉與煮熟魚肉和蒸熟魚肉呈味強(qiáng)度值差異顯著（p<0.05）。5’-GMP和5’-IMP的呈味強(qiáng)度值在各種條件下均大于1。5’-IMP含量是衡量水產(chǎn)品新鮮程度的重要指標(biāo)，在生鮮魚肉中含量高于煮制和蒸制條件，并且5’-IMP含量在生鮮魚肉中達(dá)到6.66，說明5’-IMP對鏡鯉魚滋味有極其重要貢獻(xiàn)。由于5’-CMP和5’-UMP的味道閾值數(shù)據(jù)尚未見文獻(xiàn)報道，所以本實驗不討論這二種核苷酸的呈味強(qiáng)度值。

3 結(jié)論

采用C18液相色譜柱，以甲醇和0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液pH為4.1條件下，做為流動相。在紫外檢測器波長為260nm下，以流速1mL/min等度洗脫，可以將5種呈味核苷酸很好地分離。5’-GMP和5’-IMP對鏡鯉魚滋味有重要貢獻(xiàn)。該方法簡單、操作簡便，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可以應(yīng)用于肉類食品及水產(chǎn)品的呈味核苷酸的分析檢測。

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Determination of the different heat treatment in mirror carp meat flavor nucleotides by HPLC

CAO Wei，XU Xiao-xi*
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The highly effective liquid phase chromatography was used to determine the mirror carp to live fresh，boiled，steams，in three kind of processing ways’fish flesh assumed the taste nucleotide the content.The chromatographic column is Ultimate AQ-C18（4.6×250mm，5μm），the mobile phase：A：methyl alcohol solution，B：0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate solution（pH4.1），isocratic elution 1mL/min，detection wavelength 260nm，column temperature was 30℃.The results showed that 5 kinds of flavor nucleotides separating well，5’-CMP，5’-GMP and 5’-IMP content in the cooked and steamed conditions were very different and fresh. The cooking and steaming heat mirror carp had no significant differences between the two nucleotides.The 5’-UMP was detected in fresh fish，under the boils and steams system condition not to pick out，the 5’-AMP has not been picked out under three kind of conditions.

HPLC；mirror carp；flavor nucleotides

TS254.1

A

1002-0306（2012）03-0136-03

2010－11－16 *通訊聯(lián)系人

曹偉（1984-），男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及儲藏。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊項目（CXZ011-01）。