高產木聚糖酶嗜熱子囊菌固體發(fā)酵條件與酶學性質

龐宗文，郭法謀，徐 勇，梁靜娟，彭 幸，陸 薇

（廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530005）

高產木聚糖酶嗜熱子囊菌固體發(fā)酵條件與酶學性質

龐宗文，郭法謀，徐 勇，梁靜娟，彭 幸，陸 薇

（廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530005）

以本實驗室從土壤中分離篩選到的一株高產木聚糖酶的嗜熱子囊菌QS7-2-4為生產菌種，進行固體發(fā)酵產木聚糖酶的發(fā)酵條件研究，結果表明最佳產酶條件為：玉米芯∶麩皮為7∶3（w/w）；最佳氮源為酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源，添加量為1.5%；吐溫-80添加量為0.5%，初始pH為7.2，培養(yǎng)基含水量為80%，250mL三角瓶裝料量為8g，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間72h，該條件下木聚糖酶產量達27952U/g干基。該酶最適反應溫度為75℃，最適反應pH為4.5，在70℃以下具有良好的穩(wěn)定性，在室溫下儲藏150d仍然保留87%的活性。

木聚糖酶，固體發(fā)酵，嗜熱子囊菌

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）QS7-2-4從廣西各地采集的土樣中分離篩選并鑒定，保藏在本實驗室；玉米芯、甘蔗渣、玉米秸稈、稻草 取自農田，經(jīng)干燥粉碎后過40目篩備用；麩皮 購自農貿市場；樺木木聚糖和木糖 Sigma公司，純度大于99%；其他試劑 均為國產分析純；PDA平板培養(yǎng)基 去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH自然；固體發(fā)酵培養(yǎng)基 稱取8g碳源于250mL三角瓶中，加入32mL營養(yǎng)鹽溶液，pH自然，121℃滅菌30min；營養(yǎng)鹽溶液（g/L） K2HPO42.4，（NH4）2SO41.5，KH2PO41.0，CaCl20.3，MgSO40.3，尿素0.7，酵母浸膏4.8，吐溫-80 1.7，微量元素液1.0mL，蒸餾水充分溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用；微量元素液（g/L） ZnSO41.4，MnSO41.6，CoCl22.0，F(xiàn)eSO42.5，用蒸餾水充分溶解。

1.2 實驗方法

1.2.1 固體發(fā)酵和粗酶液的制備 將保藏的菌種接種到PDA平板上，50℃培養(yǎng)96h進行活化。挑取3環(huán)菌絲接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后置50℃培養(yǎng)96h。稱取濕曲5g于干燥三角瓶中，加入150mL的0.05mol/L pH4.8的檸檬酸緩沖溶液，置180r/min的搖床上室溫浸提2h，4℃冷凍離心（12000r/min，10min），上清液即為木聚糖酶粗酶液。同時稱取濕曲5g放入干燥培養(yǎng)皿中，放入100℃烘箱中烘干至恒重。

1.2.2 固體發(fā)酵產酶條件的優(yōu)化 在250mL三角瓶中分別考察不同的碳源、氮源、裝料量、含水量、培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、吐溫-80添加量等因素對產酶的影響。

1.2.3 木聚糖酶的酶學性質初探 分別考察粗酶液中木聚糖酶的最佳反應溫度、最佳反應pH以及溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性。

1.2.4 木聚糖酶活力的測定 酶活測定采用DNS法：將0.1mL適當稀釋的粗酶液加入到15mL的具塞試管中，加入1%（w/v）用pH4.8的檸檬酸緩沖溶液配制的樺木木聚糖溶液0.9mL，70℃反應10min。冰浴迅速冷卻，加入1.5mL DNS試劑，充分混勻后置沸水浴中煮沸5min，迅速用冷水冷卻至室溫，于540nm下測定產生的還原糖量，用滅活酶液作空白對照。酶活力定義：在70℃、pH4.8條件下，每分鐘生成1μmol木糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

2 結果與分析

2.1 產木聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化

圖1 不同單一碳源對菌株QS7-2-4產木聚糖酶的影響Fig.1 Effect of carbon source on xylanase production of QS7-2-4

2.1.1 不同碳源對產木聚糖酶的影響 采用麩皮、玉米芯、玉米桿、稻草秸稈、花生殼、木薯渣、木薯桿渣為單一碳源進行固體發(fā)酵產酶實驗，結果如圖1所示。圖1結果表明，以麩皮、玉米芯為碳源時木聚糖酶產量較高，分別達到12956U/g干基和9876U/g干基。以麩皮、玉米芯為主要原料進行復合碳源實驗，結果如圖2所示。由圖2可知當玉米芯∶麩皮為7∶3時木聚糖酶活力最高，達到16437U/g干基，比單一碳源有較大幅度提高，以下所作發(fā)酵條件均以玉米芯∶麩皮（7∶3）作為碳源。

圖2 玉米芯與麩皮的不同比例對QS7-2-4產木聚糖酶的影響Fig.2 Effect of different ratio of corncob to wheat bran on xylanase production of QS7-2-4

2.1.2 不同氮源對發(fā)酵產木聚糖酶的影響 以玉米芯∶麩皮（7∶3）作為碳源，去除營養(yǎng)鹽溶液中的氮源，分別添加不同的氮源，考察不同氮源對發(fā)酵產木聚糖酶的影響，氮源的添加量以碳源量為基準計算。實驗結果如表1所示。表1實驗結果表明有機氮源普遍好于無機氮源，在無機氮源中以添加1.0%（NH4）2SO4的培養(yǎng)基產酶水平最高，達到17020.51U/g干基，在有機氮源中以酵母浸膏和胰蛋白胨混合氮源時產酶活性最高，達到23169.23U/g干基。另外，在選用廉價的農副產品花生麩和豆粕作為氮源時也取得了良好的效果，添加5%花生麩木聚糖酶活力達到18844.87U/g干基，添加8%豆粕木聚糖酶活力可達到19120.88U/g干基，這一實驗結果將為工業(yè)化生產提供重要的參考。

表1 不同氮源對發(fā)酵QS7-2-4產木聚糖酶的影響Table 1 Effect of nitrogen sources on fermentation of QS7-2-4 xylanase production

2.1.3 三角瓶裝料量對產木聚糖酶的影響 裝料量對木聚糖酶產量的影響如圖3所示，在較少的裝料量情況下，水分散失較快，菌體生長受到影響，木聚糖酶產量較低。在較多的裝料量的情況下，固體曲內部散熱及氧傳遞困難，故木聚糖酶產量也較低。實驗表明，在250mL三角瓶中，最佳裝料量為8g，此時木聚糖酶產量可達22161U/g干基。

圖3 培養(yǎng)基裝料量對QS7-2-4產木聚糖酶的影響Fig.3 Effect of the amount of medium in 250mL flask on xylanase production of QS7-2-4

2.1.4 發(fā)酵溫度對產木聚糖酶的影響 將固體發(fā)酵培養(yǎng)基分別在35、40、45、50、55、60℃下培養(yǎng)4d，考察發(fā)酵溫度對產木聚糖酶的影響，結果如圖4所示。QS7-2-4在50℃下發(fā)酵其產木聚糖酶能力最強，發(fā)酵4d木聚糖酶活力可達24233U/g干基。菌體在35、40、45℃發(fā)酵時生長緩慢，當發(fā)酵至84h時，菌體才剛長滿培養(yǎng)基。而在55℃發(fā)酵時，菌體能較快生長，但過早衰老，且培養(yǎng)基的水分散失較快，不利于產酶。在60℃培養(yǎng)時，只有少量菌體生長且很快衰老，水分散失很快。QS7-2-4的最佳發(fā)酵溫度為50℃。

圖4 發(fā)酵溫度對QS7-2-4產木聚糖酶的影響Fig.4 Effect of temperature on xylanase production of QS7-2-4

圖5 培養(yǎng)基初始pH對QS7-2-4產木聚糖酶的影響Fig.5 Effect of initial medium pH on xylanase production of QS7-2-4

2.1.5 培養(yǎng)基初始pH對產木聚糖酶的影響 將營養(yǎng)鹽溶液調至不同的pH，并以此pH不同的營養(yǎng)鹽溶液配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基。接種后在50℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，測定木聚糖酶活力，結果如圖5所示。從圖5可以看出初始pH對木聚糖酶的產量影響不顯著，因初始營養(yǎng)鹽溶液的pH為7.2，因此QS7-2-4發(fā)酵木聚糖酶的pH為7.2。

2.1.6 發(fā)酵時間對產木聚糖酶的影響 固體發(fā)酵于50℃下進行，每隔6h取樣測定酶活，QS7-2-4產木聚糖酶的時間過程如圖6所示。當發(fā)酵至48h時，發(fā)酵基質中長滿菌體，木聚糖酶活力也迅速升高。之后菌體量不再明顯增加，主要為產酶階段，當發(fā)酵至72h時，酶活力達到22948U/g干基，之后酶活力基本穩(wěn)定。因此QS7-2-4產木聚糖酶的最適時間為72h，這是目前國內耐熱木聚糖酶發(fā)酵時間最短的菌株，其他報道的菌株大部分需要5~7d或需要更長時間。

圖6 發(fā)酵時間對QS7-2-4產木聚糖酶的影響Fig.6 Effect of fermentation time on xylanase production of QS7-2-4

2.1.7 吐溫-80添加量對產木聚糖酶的影響 在固體培養(yǎng)基中分別添加不同量的吐溫-80，置50℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72h，測定木聚糖酶活力，結果如圖7所示。吐溫-80是一種表面活性劑，可促進細胞產生的木聚糖酶釋放至細胞外，降低木聚糖酶的阻遏作用，提高木聚糖酶產量。當吐溫-80的添加量從0.1%增至0.5%時，木聚糖酶產量隨之提高；添加量為0.5%～1.1%時酶產量穩(wěn)定；但過高含量的吐溫-80又對細胞產生毒害作用，當吐溫-80添加量大于1.1%時，木聚糖酶產量降低。從酶活力與經(jīng)濟角度考慮，吐溫-80最適添加量為0.5%。

圖7 吐溫-80添加量對QS7-2-4產木聚糖酶的影響Fig.7 Effect of Tween-80 content on xylanase production of QS7-2-4

2.1.8 固體曲含水量對產木聚糖酶的影響 固體曲含水量對產酶的影響如圖8所示。含水量對固體曲發(fā)酵產酶影響顯著，含水量過高或過低都不利于營養(yǎng)物的利用、菌體的生長及酶的產生。含水量過低時，菌體生長緩慢且水分蒸發(fā)較快，使菌體因缺水而造成代謝緩慢甚至停止，造成產酶量較低。含水量過高時則會引起培養(yǎng)基粘結，使氧傳遞困難、培養(yǎng)基內部溶氧不足，使菌體生長繁殖緩慢，而且容易造成燒曲，從而影響酶產量。因此需要使培養(yǎng)基的含水量適度，從圖8可以看出最佳含水量為80%，此時菌體產酶達到最大值27952U/g干基。

圖8 固體曲含水量對QS7-2-4產木聚糖酶的影響Fig.8 Effect of water content in solid medium on xylanase production of QS7-2-4

2.2 QS7-2-4木聚糖酶酶學性質

2.2.1 木聚糖酶的最適反應溫度 分別在不同的反應溫度下測定粗酶液中的木聚糖酶活力，結果如圖9所示。當反應溫度從40℃上升到75℃時，木聚糖酶活力隨溫度升高顯著增強，75℃時酶活力達到最大值24032U/g干基，且酶活在70～80℃之間差異不大。當反應溫度超過80℃時，酶活力迅速下降。因此QS7-2-4木聚糖酶的最適反應溫度為70～80℃。

圖9 溫度對QS7-2-4木聚糖酶活力的影響Fig.9 Effect of temperature on xylanase activity of QS7-2-4

2.2.2 木聚糖酶的最適反應pH 分別在不同pH的緩沖液下測定粗酶液中的木聚糖酶活力，結果如圖10所示。從圖10可知，pH對QS7-2-4木聚糖酶的酶活力影響比較顯著，最適pH范圍也比較窄，為4.5，當pH大于6.5或低于4.0時，酶活力迅速降低。在pH為4.5~ 5.5范圍內，該木聚糖酶有較高的酶活力。

圖10 pH對QS7-2-4木聚糖酶活性的影響Fig.10 Effect of pH on xylanase activity of QS7-2-4

2.2.3 木聚糖酶的熱穩(wěn)定性 在pH4.8的檸檬酸鈉緩沖液中，將酶液分別在30、40、50、60、70、80℃恒溫水浴鍋中保溫1h，然后在70℃下測定其木聚糖酶活，結果如圖11所示。從圖11可知，在40～60℃條件下保溫1h木聚糖酶的酶活力基本不變，在70℃條件下保溫1h木聚糖酶的殘余酶活力為88.41%，而在80℃下保溫酶活力迅速降低，保溫1h后殘余酶活力只有5.84%。說明該木聚糖酶在70℃以下穩(wěn)定，溫度高于70℃將破壞該酶蛋白的空間結構，使該酶失去活性。

圖11 溫度對QS7-2-4木聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of temperature on xylanase stability of QS7-2-4

2.2.4 木聚糖酶的pH穩(wěn)定性 分別將木聚糖酶的粗酶液調至不同的pH，室溫放置60min，然后在pH4.8、70℃條件下測定殘余的木聚糖酶活力。以原始粗酶液（pH4.8）的酶活力為100%，計算相對酶活，結果如圖12所示。從圖中可以看出，該木聚糖酶在pH4.5～5.5之間比較穩(wěn)定，放置60min后殘余的木聚糖酶活力都在95%以上，pH低于4.0或高于6.0均導致該木聚糖酶的快速失活。

圖12 pH對QS7-2-4木聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of pH on xylanase stability of QS7-2-4

2.2.5 木聚糖酶的儲藏穩(wěn)定性 在木聚糖酶的粗酶液（pH4.8）中加入適量的防腐劑，分別在室溫和4℃冰箱中放置，定期取樣測定木聚糖酶的酶活，結果如圖13所示。從圖中可以看出，該木聚糖酶具有良好的儲藏穩(wěn)定性，在室溫下放置150d還能保持87%的活性。

圖13 儲藏時間對QS7-2-4木聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.13 Effect of stored time on xylanase stability of QS7-2-4

3 結論與討論

本研究從自然界土壤樣品中篩選到一株高產木聚糖酶的嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）QS7-2-4，其固體發(fā)酵產木聚糖酶的最佳條件為：玉米芯∶麩皮為7∶3（w/w）；最佳氮源為酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源，添加量為1.5%；吐溫-80添加量為0.5%，初始pH為7.2，培養(yǎng)基含水量為80%，250mL三角瓶裝料量為8g，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間72h，該條件下木聚糖酶產量達27952U/g干基。該酶的最適反應溫度為75℃，最適反應pH為4.5，在70℃以下具有良好的穩(wěn)定性，在室溫下儲藏150d仍然保留87%的活性。

木聚糖酶在飼料加工、造紙漂白、面包改良及啤酒和果汁的澄清中有廣泛的應用，目前市場上的木聚糖酶絕大多數(shù)是中低溫木聚糖酶，其最適酶反應溫度為50℃，熱穩(wěn)定性較差，通常超過60℃活性基本喪失，難以滿足某些工業(yè)應用過程要求。如在啤酒制造過程中，木聚糖酶通常在大麥液化和糖化工段加入，此時的料溫一般為70～80℃左右，傳統(tǒng)的中低溫木聚糖酶在此溫度下很快就失去其活性，不適合用于啤酒行業(yè)。而本研究所獲得的木聚糖酶的最適反應溫度為75℃，具有良好的溫度穩(wěn)定性，非常適合于啤酒生產過程的澄清工藝，是一種很有工業(yè)化生產應用前景的木聚糖酶。

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Optimization of xylanase production conditions by Thermoascus aurantiacus QS7-2-4 in solid state fermentation and the properties of xylanase

PANG Zong-wen，GUO Fa-mou，XU Yong，LIANG Jing-juan，PENG Xing，LU Wei
（College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China）

The conditions in solid fermentation of a strain of Thermoascus aurantiacus QS7-2-4 with high yield of xylanase were studied.The research results indicated that the optimum fermentation conditions were：corncob：wheat bran was 7∶3（w/w），the initial pH was 7.2，the water content of medium was 80%，the feeding amount in 250mL flask was 8g，fermentation temperature was 50℃，fermentation time was 72h，the amount of Tween-80 was 0.5%，the best nitrogen source was 1.5%of peptone.The activity of xylanase under the optimum fermentation condition reached 27952U/g.The optimum temperature and pH of this xylanase were 75℃ and 4.5，respectively.The xylanase was stable when the temperature was below 70℃.The activity of xylanase remained 87%after stored for 150d at room temperature.

xylanase；solid state fermentation；Thermoascus aurantiacus

TS201.3

A

1002-0306（2012）03-0170-05

木聚糖是植物半纖維素的主要組分，在自然界中含量僅次于纖維素，主鏈由木糖殘基以β-1，4糖苷鍵連接而成，木聚糖的降解對于植物資源的利用具有重要的意義。水解木聚糖的酶主要是內切β-1，4木聚糖酶和β-木糖苷酶，β-1，4木聚糖酶是一類以內切方式水解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷鍵的酶類，水解產物主要為不同聚合度的木寡糖和少量木糖，是木聚糖降解酶中最關鍵的酶[1-2]。近年來，木聚糖酶在飼料、造紙、食品加工及燃料乙醇生產等行業(yè)都有廣泛的應用。如在制漿造紙工業(yè)中用于紙漿的生物漂白，在食品工業(yè)中用于功能性低聚木糖制造、面團改良劑以及改善啤酒工業(yè)的麥汁和啤酒的過濾澄清等，在飼料工業(yè)中作為飼料添加劑可有效分解飼料中的抗營養(yǎng)因子[2-8]。由于木聚糖酶在許多工業(yè)應用過程中常需要在高溫下進行操作，因此對耐熱木聚糖酶的研究開發(fā)已引起了國內外學者的高度重視，在以嗜熱真菌生產耐熱木聚糖酶的研究與開發(fā)方面已經(jīng)取得了一些有工業(yè)化生產價值的研究成果[9-12]。本實驗室從土壤中分離篩選到的一株高產木聚糖酶的嗜熱子囊菌Thermoascus aurantiacus QS7-2-4，本文主要研究該菌固體發(fā)酵產木聚糖酶的發(fā)酵工藝條件，并對其產生的木聚糖酶的酶學性質進行了初步的研究，為耐熱木聚糖酶的工業(yè)化生產及應用提供科學依據(jù)。

2011－05－09

龐宗文（1984-），男，博士，副教授，研究方向：微生物酶學及生物質能源。