醬油制曲過程中蛋白質(zhì)的降解規(guī)律研究

歐陽(yáng)珊，馮云子，徐歡歡，崔 春，趙謀明

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

醬油制曲過程中蛋白質(zhì)的降解規(guī)律研究

歐陽(yáng)珊，馮云子，徐歡歡，崔 春*，趙謀明

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

研究了醬油制曲過程中總氮含量、氮溶指數(shù)、氨基酸轉(zhuǎn)化率、揮發(fā)性鹽基氮含量及可溶性多肽分子量分布的變化規(guī)律；結(jié)果表明：豆粕曲和大豆曲的總氮含量、氮溶指數(shù)、氨基酸轉(zhuǎn)化率均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，培養(yǎng)48h后，豆粕曲和大豆曲的總氮含量分別提高了15.89%和12.43%，豆粕曲和大豆曲的氮溶指數(shù)分別達(dá)到26.37%和34.45%；氨基酸轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到12.11%和16.00%，大曲的氨基酸轉(zhuǎn)化率與氮溶指數(shù)呈明顯正相關(guān)。不同培養(yǎng)時(shí)段的豆粕曲和大豆曲的肽分子量均以1000~5000u為主，制曲結(jié)束后，分別占肽總量的63.55%和67.62%。

醬油，大曲，總氮，氮溶指數(shù)，分子量分布

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆、豆粕、面粉 均為市售；曲精 滬釀3.042孢子粉，孢子發(fā)芽率≥80%，孢子數(shù)≥300億/g干基，水分≤10%。

EL3002電子天平，A1430霉菌培養(yǎng)箱，LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，KDN-2C定氮儀，GL-21M高速冷凍離心機(jī)，Tin840自動(dòng)電位滴定儀，Amersham蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制曲工藝 大豆清洗除雜，溫水浸泡6~8h，125℃下蒸煮12min，冷至40℃左右；豆粕于121℃下干蒸12min，按80%的量潤(rùn)水，靜置10~20min，于125℃下濕蒸10min，

冷至40℃左右；均按4∶1的比例與面粉混合拌勻，接種0.05%的曲精，平鋪在曲盤，于霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在制曲0、12、24、36、40、44、48h時(shí)分別取樣。

1.2.2 樣品處理[7]將培養(yǎng)不同時(shí)段的大曲粉碎，冷凍干燥后再次粉碎，冷藏備用；準(zhǔn)確稱取20g冷凍干燥后粉碎的干曲，加100mL去離子水，于常溫下振蕩提取20min，而后6000r/min離心25min，取上清液，取40mL水洗滌沉淀，重復(fù)上述操作兩次，合并三次上清液，定容至200mL，待測(cè)液冷藏備用。

1.2.3 基本指標(biāo)的測(cè)定 蛋白酶活力測(cè)定：取粉碎后的濕曲，按GB/T 23527-2009測(cè)定；總氮、總酸測(cè)定：取粉碎后的干曲，分別按GB/T 5009.5-2010和GB/T 12456-2008測(cè)定；可溶性氮、氨基酸態(tài)氮測(cè)定：取待測(cè)液，分別按GB/T 5009.5-2010和GB/T 5009.39-2003測(cè)定；揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定：取待測(cè)液，按GB/T 5009.44-2003測(cè)定；氮溶指數(shù)（NSI）的測(cè)定：NSI（%）=可溶性氮含量/總氮含量×100%；氨基酸轉(zhuǎn)化率的測(cè)定：氨基酸轉(zhuǎn)化率（%）=氨基酸態(tài)氮含量/總氮含量×100%。

1.2.4 可溶性肽分子量分布測(cè)定[8]凝膠色譜條件：Amersham蛋白質(zhì)分析純化系統(tǒng)；Superde-peptide-10/ 300 GL分析柱；洗脫液為0.25mol/L NaCl，0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.2）；流速為0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm；進(jìn)樣體積為100μL。Superde-peptide-10/ 300 GL預(yù)裝柱：Vt=24.0，V0=8.0，最大壓力=1.8MPa，默認(rèn)流速0.5mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油大曲中蛋白酶活力的變化規(guī)律

圖1 制曲過程中大曲蛋白酶活力的變化曲線Fig.1 Curves of protease activity variation in koji-making process

蛋白酶活力是評(píng)價(jià)成曲質(zhì)量的重要理化指標(biāo)[9]。由圖1可知，從米曲霉菌絲生長(zhǎng)期到孢子繁殖期，豆粕曲和大豆曲中酸性蛋白酶活力均快速增長(zhǎng)，36h后，蛋白酶活增長(zhǎng)趨于平緩。這是由于米曲霉菌絲體生長(zhǎng)過程中伴隨著蛋白酶的分泌，在孢子著生期和繁殖期，菌絲體斷裂生成孢子，釋放大量蛋白酶，使蛋白酶活力快速增加；制曲后期，米曲霉逐漸衰老，產(chǎn)酶速率下降，部分蛋白酶活性下降，大曲蛋白酶活力升高緩慢。

2.2 醬油大曲中總氮的變化規(guī)律

由圖2可知，在米曲霉孢子萌發(fā)期和菌絲生長(zhǎng)初期（至12h），豆粕曲和大豆曲中總氮含量增加緩慢。當(dāng)米曲霉進(jìn)入菌絲繁殖期（12~38h），曲料中總氮含量顯著增加；豆粕曲中總氮含量從8.10g/100g上升至9.43g/100g，提高了17.88%，大豆曲中總氮含量從5.97g/100g上升至6.51g/100g，提高了9.05%。在孢子著生期，豆粕曲和大豆曲中總氮含量均變化緩慢，這與Ling[10]等研究結(jié)果相符。制曲過程中大曲總氮含量升高是由于米曲霉在生長(zhǎng)繁殖時(shí)消耗大量碳源和氨基酸，其中碳源通過呼吸作用降解為二氧化碳和水分而大量消耗[3]，而氮素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被代謝的產(chǎn)物幾乎均留于曲料中；因此在菌絲繁殖期，菌絲的大量繁殖使曲料中糖類物質(zhì)的消耗增大，總氮含量有明顯提高；培養(yǎng)后期微生物進(jìn)入產(chǎn)孢期，米曲霉碳源消耗較少，總氮含量變化趨于平緩。

圖2 制曲過程中大曲總氮含量的變化曲線Fig.2 Curves of changes in content of total nitrogen in kojimaking process

2.3 醬油大曲中氮溶指數(shù)的變化規(guī)律

圖3 制曲過程中大曲氮溶指數(shù)（NSI）的變化曲線Fig.3 Curves of NSI variation in koji-making process

由圖3可知，豆粕曲和大豆曲初始NSI分別為13.40%和14.46%，在米曲霉菌絲生長(zhǎng)繁殖期，NSI大幅度增加，24h時(shí)，豆粕曲和大豆曲的NSI分別達(dá)到31.94%和31.07%；24h后，孢子逐漸成熟，豆粕曲和大豆曲NSI的變化趨勢(shì)有所差異，豆粕曲NSI略呈下降趨勢(shì)，48h后，NSI為26.37%；而大豆曲NSI仍緩慢上升，48h后NSI為34.45%。制曲前24h，NSI顯著上升，是由于制曲過程中米曲霉分泌各種蛋白酶類，將曲料中一些不溶性蛋白降解為小分子肽、氨基酸等可溶性含氮物[11]，導(dǎo)致曲料NSI升高；制曲24h后，NSI增長(zhǎng)緩慢或呈下降趨勢(shì)，可能是由于孢子的大量繁殖消耗大量可溶性氮源，以及制曲后期大曲水分含量下降，水分活度降低，蛋白酶的酶解效率降低等因素的共同作用。

2.4 醬油大曲中氨基酸轉(zhuǎn)化率的變化規(guī)律

氨基酸轉(zhuǎn)化率是評(píng)價(jià)大曲中游離氨基酸占總氮比例的指標(biāo)。由圖4可知，在米曲霉菌絲生長(zhǎng)期和孢子著生期，大曲氨基酸轉(zhuǎn)化率大幅度增加，24h時(shí)，豆粕曲和大豆曲氨基酸轉(zhuǎn)化率分別為13.47%和13.05%，培養(yǎng)24h后，豆粕曲的氨基酸轉(zhuǎn)化率略微下降，而大豆曲的氨基酸轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢(shì)，制曲結(jié)束時(shí)，豆粕成曲和大豆成曲氨基酸轉(zhuǎn)化率分別為12.11%和16.00%。將豆粕大曲和大豆大曲制曲過程中的氨基酸轉(zhuǎn)化率和NSI進(jìn)行相關(guān)性分析，其相關(guān)系數(shù)分別為0.89和0.90，具有較好相關(guān)性，原因是可溶性氮本身包括游離氨基酸、可溶性肽和可溶性蛋白。目前我國(guó)高鹽稀態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)醬油的氨基酸轉(zhuǎn)化率一般為60%~ 65%，可見原醬油中相當(dāng)一部分氨基酸已在醬油制曲過程中形成。

圖4 制曲過程中大曲氨基酸轉(zhuǎn)化率的變化曲線Fig.4 Curves of changes in conversion rates of amino acid in koji-making process

2.5 醬油大曲中可溶性肽分子量的分布規(guī)律

大曲的凝膠色譜圖如圖5所示，分子量分布百分比如表1所示。

圖5 制曲過程中大曲可溶性肽分子量分布譜圖Fig.5 Chromatographic graphs of molecular weight distribution of soluble peptide in koji-making process

由圖5可以看出，豆粕曲和大豆曲在相同培養(yǎng)時(shí)段的大曲凝膠色譜譜圖峰形基本一致，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，大分子量肽含量逐漸減小，小分子量肽含量逐漸增多，且凝膠色譜圖中肽峰不斷向后推移且峰值增加。醬油制曲過程中，米曲霉分泌的各種蛋白酶將大分子蛋白質(zhì)及多肽降解成小分子肽和氨基酸等[1]。由表1可知，0h時(shí)，豆粕曲和大豆曲肽分子量均集中在＞10000u和1000~5000u，分別占總量的31.37%（MP）、42.84%（MD）和46.20%（MP）、38.88%（MD）。隨著米曲霉菌絲生長(zhǎng)繁殖，曲料中＞10000u的大分子蛋白質(zhì)和多肽逐漸被降解，分子量在1000~5000u及＜1000u的小分子量肽含量逐漸增加。制曲結(jié)束后，分子量＞10000u的肽含量均占肽總量的11.08%（MP，MD），5000~10000u的肽含量變化不大，分子量主要集中在1000~5000u，分別占總量的63.55%（MP）和67.62%（MD），分別提高了17.35%（MP）和28.74%（MD），＜1000u的肽含量分別提高了3倍（MP）和1倍（MD）左右。

2.6 醬油大曲中揮發(fā)性鹽基氮和總酸的變化規(guī)律

圖6 制曲過程中大曲揮發(fā)性鹽基氮含量的變化曲線Fig.6 Curves of TVB-N content variation in koji-making process

表1 制曲過程中大曲可溶性肽分子量的分布（%）Table 1 Molecular weight distribution of soluble peptide in koji-making process（%）

揮發(fā)性鹽基氮是一些以氨為主，含有伯胺、仲胺、叔胺等含氮化合物，它的形成主要是曲料發(fā)酵過程中雜菌將氨基酸進(jìn)一步分解、轉(zhuǎn)化為氨和胺類等揮發(fā)性鹽基含氮化合物[12]，因此揮發(fā)性鹽基氮可作為評(píng)價(jià)大曲雜菌繁殖程度的簡(jiǎn)易指標(biāo)。由圖6可知，制曲過程中，豆粕曲和大豆曲揮發(fā)性鹽基氮含量整體呈上升趨勢(shì)，培養(yǎng)48h后，豆粕曲和大豆曲中揮發(fā)性鹽基氮含量分別為初始含量的4.8倍和4.5倍。豆粕曲制曲后期揮發(fā)性鹽基氮含量有所下降，可能是由于豆粕曲水分蒸發(fā)較快，水分含量低，揮發(fā)性含氮物質(zhì)蒸發(fā)而減少[12]。

由圖7可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，豆粕曲和大豆曲總酸隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢(shì)，24h時(shí)大曲的總酸含量最高，分別達(dá)到2.24g/100g和2.01g/100g。在米曲霉菌絲生長(zhǎng)期，米曲霉利用葡萄糖產(chǎn)酸，以及氨基酸含量的升高，使曲料總酸含量增加。此外，有研究[9]報(bào)道曲料中乳酸菌的繁殖也可能導(dǎo)致大曲的pH下降、總酸含量上升顯著；制曲后期（24~48h）總酸含量降低可能與揮發(fā)性鹽基氮含量增加有關(guān)。

圖7 制曲過程中大曲總酸含量的變化曲線Fig.7 Curvesoftotalacidcontentvariationinkoji-makingprocess

3 結(jié)論

3.1 醬油制曲過程中各氮素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化顯著，不同蛋白原料制曲氮素營(yíng)養(yǎng)變化趨勢(shì)有一定差異。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，豆粕曲NSI和氨基酸轉(zhuǎn)化率先大幅度提高，24h后均略有下降，而大豆曲NSI和氨基酸轉(zhuǎn)化率在制曲過程中均呈上升趨勢(shì)，NSI和氨基酸轉(zhuǎn)化率變化趨勢(shì)呈線性相關(guān)（r=0.89，0.90）。經(jīng)過48h的培養(yǎng)，揮發(fā)性鹽基氮含量在豆粕曲和大豆曲中均有較大增長(zhǎng)。

3.2 豆粕曲和大豆曲肽分子量分布無顯著差異。大曲中可溶性肽分子量主要集中在1000~5000u，占大曲中可溶性肽總量的63%~70%。

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Study on protein degradation rules during soy sauce koji-making

OUYANG Shan，F(xiàn)ENG Yun-zi，XU Huan-huan，CUI Chun*，ZHAO Mou-ming
（College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The aim was to study the changes of total nitrogen content，NSI，amino acid conversion rate，TVB-N content and molecular weight distribution.The results showed that the total nitrogen content and amino acid conversion rate of both soybean koji and defatted soybean koji increased during fermentation.After cultivation for 48h，the total nitrogen contents of soybean koji and defatted soybean koji increased by 15.89%and 12.43%，and NSI increased by 26.37%and 34.45%respectively.The conversion rates of amino acid in defatted soybean kojis and soybean koji increased by 12.11%and 16.00%，respectively.The amino acid conversion rate and NSI of koji had significantly positive correlation.Molecular weight of peptides was mainly distributed between 1000u and 5000u，accounting for 63.55%and 67.62%of the total peptides in mature soybean koji and defatted soybean koji，respectively.

soy sauce；koji；total nitrogen；NSI；molecular weight distribution

TS264.2+1

A

1002-0306（2012）07-0195-04

醬油是以大豆和小麥面粉為主要原料，經(jīng)過固體制曲和液體醬醪發(fā)酵兩個(gè)重要階段，制備成具有特征色、香、味、體的液體調(diào)味品。制曲是醬油生產(chǎn)的重要工藝[1-2]，制曲過程中米曲霉在原料上的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生醬油發(fā)酵所需的各種水解酶類，如淀粉酶和蛋白酶等，為后期醬醪發(fā)酵奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)，醬油制曲過程中部分蛋白質(zhì)和淀粉被米曲霉所分泌的水解酶降解，生成小分子肽、氨基酸和單糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)可為米曲霉的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶和產(chǎn)孢子提供營(yíng)養(yǎng)[3]。因此，研究醬油制曲過程中蛋白質(zhì)的降解規(guī)律對(duì)調(diào)控米曲霉生長(zhǎng)具有重要意義。近年來，國(guó)內(nèi)關(guān)于提高醬油蛋白質(zhì)利用率和氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率的文獻(xiàn)較多[4-6]，但詳細(xì)探討醬油制曲過程中蛋白質(zhì)變化規(guī)律的研究鮮見報(bào)道。本研究將以豆粕、大豆分別制曲，通過研究醬油制曲過程中全氮、氮溶指數(shù)、氨基酸轉(zhuǎn)化率、揮發(fā)性鹽基氮及可溶性多肽的分子量分布的變化規(guī)律，為醬油發(fā)酵的代謝調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

2011－05－09 *通訊聯(lián)系人

歐陽(yáng)珊（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項(xiàng)目（2009z52）。