KISS-I／MMP-9對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)及意義研究

傅向紅，夏建妹，吳瑞瑾

（1.衢州市人民醫(yī)院，浙江 衢州 324002；2.杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006；3.浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州 310016）

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）是一種育齡婦女常見(jiàn)且難治的良性疾病，發(fā)病率較高，且有逐年上升趨勢(shì)，所引起的痛經(jīng)、下腹痛及不孕癥，對(duì)育齡婦女的身體健康與生活質(zhì)量造成了極大影響。但至今本病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此臨床難以找到徹底根治的療法，但其具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、廣泛種植轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)的與惡性腫瘤相似的生物學(xué)行為，使一些與腫瘤細(xì)胞遷徙相關(guān)的基因和蛋白在EMs的發(fā)病中的作用成為目前研究的熱點(diǎn)。

腫瘤抑制基因-I（KISS-I）是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，可有效抑制κβ（NF-κβ）表達(dá)，KISS-I表達(dá)下降時(shí)，抑制 NF-κβ的作用將會(huì)減弱，加強(qiáng)MMP-9的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)溶解，從而有助于腫瘤細(xì)胞的侵襲、種植，但其在EMs的研究報(bào)道國(guó)內(nèi)外較少，尤其是KISS-I的弱表達(dá)是否與月經(jīng)周期有關(guān)，以及異位內(nèi)膜的侵襲是否與月經(jīng)周期有關(guān)等問(wèn)題卻少有報(bào)道。因此本研究免疫組化方法通過(guò)檢測(cè)KISS-I及MMP-9在子宮內(nèi)膜異位癥患者增生期與分泌期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及對(duì)比研究，探討其臨床意義及兩者相關(guān)性，進(jìn)一步明確EMs的發(fā)病機(jī)制，從而從病因上找到治療EMs的方法。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源及主要試劑

選擇2009年10月－2011年10月在本院行腹腔鏡或開(kāi)腹手術(shù)的Ⅲ－Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥（按修正的美國(guó)生育協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（rAFS）分期）患者48例（分泌期20例，增生期28例），年齡27～48歲，平均年齡（43.65±4.21）歲；取卵巢異位囊腫囊壁出現(xiàn)異位內(nèi)膜組織患者為異位子宮內(nèi)膜組（ECE）。選取其中30例（分泌期10例，增生期20例）子宮內(nèi)膜患者為在位子宮內(nèi)膜組（EUE），年齡32～48歲，平均年齡（45±3）歲。選擇同期腹腔鏡或開(kāi)腹子宮切除手術(shù)患者27例（分泌期10例，增生期17例），術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜患者，取其子宮內(nèi)膜作為非子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）患者組（CE組），年齡區(qū)間30～48歲，平均（46.35±3.68）歲。排除子宮內(nèi)膜息肉，合并生殖器、子宮腺肌癥及其它系統(tǒng)的惡性腫瘤，同時(shí)6個(gè)內(nèi)未使用激素類(lèi)藥物；無(wú)心臟病史、糖尿病、高血壓等疾病，所有肝、腎功能及血、尿常規(guī)均正常。鼠抗人 MMP-9單克隆抗體，兔抗人KISS-I單克隆抗體英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；檸檬酸鹽緩沖液，PBS緩沖液，DAB顯色試劑盒，中性樹(shù)脂封片劑。

1.2 方法

分泌期、增殖期子宮內(nèi)膜組織的分組，月經(jīng)周期中，卵巢分泌的雌、孕激素作用于子宮內(nèi)膜，使其功能層具有周期性增殖、分泌和脫落性變化，基底層在月經(jīng)后再生并修復(fù)子宮內(nèi)膜創(chuàng)面，重新形成子宮內(nèi)膜功能層。據(jù)其組織學(xué)變化將月經(jīng)分為增殖期、分泌期、月經(jīng)期3個(gè)階段（以1個(gè)正常月經(jīng)周期28天為例），增殖期為月經(jīng)第5～14日，組織學(xué)上表現(xiàn)為，內(nèi)膜表面上皮、腺體、間質(zhì)、血管均呈增殖性變化；分泌期為月經(jīng)第25～28日，組織學(xué)上內(nèi)膜較厚，腺體更增長(zhǎng)、彎曲，出現(xiàn)分泌現(xiàn)象，血管迅速增加，更加彎曲，間質(zhì)疏松水腫；月經(jīng)期為月經(jīng)周期第1～4日，為子宮內(nèi)膜海綿狀功能層從基底層崩解脫落期。按照患者月經(jīng)不同周期進(jìn)行手術(shù)，采集內(nèi)膜組織，并經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為分泌期和增殖期內(nèi)膜組織。

免疫組化方法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中的KISS-I及MMP-9的表達(dá)定位：采用Envision二步法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體操作。以組織切片上出現(xiàn)黃色為陽(yáng)性反應(yīng)，免疫染色后的切片通過(guò)萊卡顯微切割系統(tǒng)讀片同時(shí)獲取圖像，使用圖像分析軟件（Image-proplus6.0）對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析，測(cè)量黃色染色部分的光密度（IOD），并計(jì)算平均光密度值（MOD）。用顯微切割系統(tǒng)在每張切片上組織染色區(qū)獲取5個(gè)不同部位的視野圖片，將免疫組化圖片輸入圖像分析軟件，分別測(cè)量各組子宮內(nèi)膜組織中陽(yáng)性部位的MOD，以空白對(duì)照，以緩沖液（PBS）取代第一抗體，其它各步不變的試劑對(duì)照染色，結(jié)果應(yīng)為陰性對(duì)照值，其值為0.15。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 KISS-I在子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織的定位表達(dá)

KISS-I在ECE組、EUE組、CE組都有不同程度的表達(dá)，主要表達(dá)在內(nèi)膜組織腺體、腺上皮細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，如圖1所示。

圖1 免疫組化法定位EMs內(nèi)膜組織中KISS-I的表達(dá)（免疫組化Envision二步法，放大400倍）

2.2 MMP-9在子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織的定位表達(dá)

MMP-9在EMs患者的異位子宮內(nèi)膜和在位子宮內(nèi)膜以及非EMs患者的子宮內(nèi)膜均有表達(dá)，MMP-9主要內(nèi)膜組織腺體及腺上皮細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達(dá)，內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞有散在的表達(dá)如纖維細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞，見(jiàn)圖2所示。

圖2 免疫組化法定位EMs內(nèi)膜組織中MPP-9的表達(dá)（免疫組化Envision法，400x）

2.3 KISS-I、MMP-9蛋白在各組子宮內(nèi)膜表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色半定量分析

KISS-I和MMP-9在各組內(nèi)膜腺體中陽(yáng)性部位的表達(dá)的平均光密度值（MOD），其陰性對(duì)照表達(dá)的平均光密度為0.15，KISS-I和 MMP-9分別在各組內(nèi)膜腺體中陽(yáng)性表達(dá)率，見(jiàn)表1。無(wú)論增生期、分泌期，子宮內(nèi)膜異位癥患者的EUE組和CE組KISS-I表達(dá)均顯著高于子宮內(nèi)膜異位癥患者的ECE組（P＜0.01），CE組KISS-I表達(dá)高于子宮內(nèi)膜異位癥患者的EUE組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 KISS-I及MMP-9在各組子宮內(nèi)膜腺體中的陽(yáng)性表達(dá)率

表2 KISS-I及 MMP-9在ECE組、EUE組、CE組平均光密度值表達(dá) （MOD，）

表2 KISS-I及 MMP-9在ECE組、EUE組、CE組平均光密度值表達(dá) （MOD，）

注：＊P＜0.05vs CE組；＊＊P＜0.01vs ECE組。

組別n KISS-I（MOD）MMP-9（MOD）ECE組48 0.15±0.11 0.61±0.13 EUE組 30 0.32±0.10＊，＊＊ 0.30±0.11＊，＊＊CE組 27 0.63±0.13＊＊ 0.15±0.09＊＊

2.4 KISS-I、MMP-9在各組不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色半定量分析

ECE組、EUE組、CE組三組中 KISS-I、MMP-9的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 KISS-I、MPP-9在各組子宮內(nèi)膜腺體中陽(yáng)性部位的平均光密度值表達(dá)（MOD，）

表3 KISS-I、MPP-9在各組子宮內(nèi)膜腺體中陽(yáng)性部位的平均光密度值表達(dá)（MOD，）

注：＊P＜0.05vsCE組；＊＊P＜0.01vsECE組。

組別 n KISS-I（MOD±s）增生期 分泌期 n MMP-9（MOD±s）增生期 分泌期ECE組 24 0.15±0.14 0.16±0.09 24 0.61±0.13 0.60±0.14 EUE組 15 0.31±0.12＊，＊＊ 0.33±0.07＊，＊＊ 15 0.29±0.12＊，＊＊ 0.33±0.11＊，＊＊CE組 14 0.61±0.14＊＊ 0.63±0.11＊＊ 13 0.14±0.06＊＊ 0.17±0.13＊＊

3 討論

至今為止EMs發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前關(guān)于異位子宮內(nèi)膜的來(lái)源有眾多學(xué)說(shuō)如Sampson種植學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)以及誘導(dǎo)學(xué)說(shuō)等，在眾多學(xué)說(shuō)中Sampson的經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)一直占據(jù)主導(dǎo)地位。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，在EMs病理發(fā)展過(guò)程中，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷徙發(fā)揮著始動(dòng)和基礎(chǔ)的作用，原因就在于經(jīng)血逆流為EMs的發(fā)病機(jī)制提供了條件，細(xì)胞遷徙是EMs發(fā)生的關(guān)鍵。細(xì)胞遷徙的過(guò)程包括：內(nèi)膜細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）黏附、基質(zhì)降解、內(nèi)膜細(xì)胞的移行以及最終在卵巢、腹膜等覆蓋宮腔內(nèi)膜以外組織種植、生長(zhǎng)。

KISS-I基因是由Lee等[1]發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移基因。當(dāng)KISS-I表達(dá)下降時(shí)，抑制NF-κβ作用就會(huì)減弱，NF-κβ表達(dá)就會(huì)提高，從而導(dǎo)致 MMP-9表達(dá)加強(qiáng)。MMP-9是MMPs組系列中的一員，能夠有效降解細(xì)胞外基質(zhì)成分。Yan等[2]研究報(bào)道，在 MMPs、mRNA呈陽(yáng)性并且缺乏KiSS-1mRNA6細(xì)胞株中，發(fā)現(xiàn)HT-1080細(xì)胞系經(jīng)KISS-I轉(zhuǎn)染后其MMP-9的量及活性明顯下降，細(xì)胞的體外侵襲性亦降低。付慧仙等[3]研究顯示，卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位子宮內(nèi)膜中MMP-9的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常子宮內(nèi)膜；MMP-9在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜中的表達(dá)與在正常對(duì)照組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)無(wú)明顯差異。劉學(xué)軍等[4]研究結(jié)果表明，異位子宮內(nèi)膜 MMP-9mRNA呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)且其表達(dá)強(qiáng)度隨著疾病嚴(yán)重程度的加重而升高，從而進(jìn)一步說(shuō)明MMP-9的高表達(dá)更利于細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的降解，從而形成新生血管，利于異位內(nèi)膜細(xì)胞異地侵襲、生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)免疫組化定位及半定量分析證實(shí)了MMP-9在異位內(nèi)膜的高表達(dá)，且ECE組、EUE組、CE組三組表達(dá)有明顯差異性，表現(xiàn)為EUE組和EUE組表達(dá)均顯著高于CE組，子宮內(nèi)膜異位癥患者的ECE組表達(dá)顯著高于EUE組。

牛慧彥等[5]將生育年齡婦女的分泌晚期子宮內(nèi)膜組織種植入裸鼠的盆腹腔，建立裸鼠EMs模型，采用RT-PCR方法，檢測(cè)不同生長(zhǎng)階段異位內(nèi)膜中 KISS-I mRNA及MMP-9mRNA的表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMs組KISS-I表達(dá)降低，而 MMP-9表達(dá)增強(qiáng)，差異顯著，故認(rèn)為KISS-I表達(dá)減弱和MMP-9表達(dá)增強(qiáng)可能與EMs的侵襲過(guò)程有關(guān)。本研究實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化半定量分析得出，非EMs患者子宮內(nèi)膜、EMs患者的在位內(nèi)膜及與之相匹配的異位內(nèi)膜KISS-I表達(dá)逐漸減弱，而MMP-9表達(dá)增強(qiáng)，并且其在各組的表達(dá)有顯著性差異，因此推測(cè)KISS-I、MMP-9可能參與EMs內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲、種植。

West等[6]通過(guò)定位研究發(fā)現(xiàn)KISS-I基因位于染色體1q32～q41位置間，由4個(gè)外顯子構(gòu)成，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲有非常密切的關(guān)系。殘基肽（Kisspeptins）作為KISS－I的衍生肽，Irwig等[7]發(fā)現(xiàn)KISS-I有可能是通過(guò)作用下丘腦弓狀核部位的GnRH神經(jīng)元，然后通過(guò)GPR54而產(chǎn)生效應(yīng)并促進(jìn)LH和FSH分泌，GnRH神經(jīng)元是Kisspeptin調(diào)節(jié)的直接靶器官，KISS-I mRNA被性腺激素調(diào)節(jié)，提示KISSI在促性腺激素分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié)中起重要作用。Gottsch等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予GnRH拮抗劑可阻斷kisspeptin的促黃體激素（LH）、促卵泡激素（FSH）釋放效應(yīng)。Roa等[9]研究kisspeptin在不同生育期雌鼠中的表達(dá)，說(shuō)明KISS-I在女性下丘腦－垂體－卵巢軸的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而EMs是激素依賴(lài)性疾病，與正常子宮內(nèi)膜一樣受卵巢激素的影響，但正常子宮內(nèi)膜受卵巢激素的調(diào)節(jié)形成無(wú)疤痕的修復(fù)，但異位內(nèi)膜且在異位組織形成過(guò)度纖維化，形成EMs，申慶文等[10]研究也證實(shí)，KISS-I在 EMs的表達(dá)降低，而EMs的侵襲轉(zhuǎn)移可能會(huì)使MMP-9的表達(dá)增高。本研究結(jié)果顯示KISS-I、MMP-9在三組內(nèi)膜之間的表達(dá)有差異，但與月經(jīng)周期的表達(dá)且無(wú)相關(guān)性，提示KISS-I基因不是影響MMP-9基因表達(dá)的唯一因素。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)證實(shí)KISS-I、MMP-9在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜的差異性表達(dá)，表明KISS-I、MMP-9可能通過(guò)參與內(nèi)膜細(xì)胞異位種植、侵襲而誘發(fā)了子宮內(nèi)膜異位癥，這為我們探討子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制以及尋找治療子宮內(nèi)膜異位癥途徑提供了一條思路。

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