六味地黃方對去卵巢雌性大鼠動脈粥樣硬化模型的影響

吳 艷，李 育， 張啟春，郭 瑤， 卞慧敏

（南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210029）

六味地黃丸出自宋代醫(yī)家錢乙所著的《小兒藥證直訣》一書，具有滋補腎陰之功效，目前臨床應用于女性更年期月經(jīng)紊亂、潮熱、盜汗、心悸、失眠、以及生殖器官與性功能變化等一系列癥狀［1］。流行病學研究表明，絕經(jīng)后女性心血管疾病發(fā)病率逐漸上升，至65～70歲女性發(fā)病率與男性相當［2］。婦女絕經(jīng)后卵巢功能減退雌激素水平下降是中老年女性心血管疾病增加的主要原因［3］。中醫(yī)認為卵巢功能失調與腎、肝、脾有密切關系，腎虛是其根本原因，治療當以補腎為主。實驗研究發(fā)現(xiàn)六味地黃方可以提高雌激素水平，防止子宮術后膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的升高，維持血脂水平［4］。為進一步研究六味地黃方對更年期動脈粥樣硬化治療作用，我們通過雌性大鼠去卵巢復制動脈粥樣硬化模型，觀察六味地黃方對更年期大鼠血脂、子宮指數(shù)、性腺軸相關激素、血管緊張素Ⅱ的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級大鼠，雌性，體質量(200±20)g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(浙)2008-0033。藥物購自亳州市中西藥有限公司，經(jīng)本校中藥鑒定室鑒定為正品，符合實驗要求。六味地黃丸(熟地黃8∶山萸肉4∶山藥4∶澤瀉3∶丹皮3∶茯苓3)依照常法煎煮，在60℃恒溫條件下，濃縮成1.0 g生藥/mL的濃縮液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 藥物及試劑 苯甲酸雌二醇購自天津金耀氨基酸有限公司，批號1 005051；維生素D3購自北京惠康源生物科技有限公司，批號2010 072601；青霉素購自哈藥集團制藥總廠，批號A091 009508；TC批號20100816、TG批號201000728、LDL批號20101025、HDL批號為20100702，試劑盒均購自北京北化康泰臨床試劑有限公司；LH批號20110224、FSH批號20110225、E2 批號20110225、AngⅡ批號20110301，試劑盒購自北京華英生物技術研究所。

1.3 儀器 低速自動平衡離心機，北京醫(yī)用離心機廠；電子天平，北京塞多利斯天平有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京東霞科學儀器廠；酶標儀，SPECTRA MAX 190，AD司；放免儀器，r-911全自動放免計數(shù)儀。

1.4 大鼠去卵巢及動脈粥樣硬化模型的建立 雌性大鼠以10%水合氯醛(劑量300 mg/kg)腹腔注射麻醉，除假手術組切除兩側卵巢下方的部分脂肪，其他組均切除兩側卵巢。術后3 d每日一次肌肉注射青霉素20萬單位，第4天開始連續(xù)5 d陰道涂片觀察動情周期，動情周期無變化證明去除卵巢徹底。參照文獻［5］方法，各實驗組及模型組喂食高脂飼料，高脂飼料按3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%普通飼料比例加工而成，同時每周加灌維生素D(按15萬IU/kg)1次［6］。在喂食高脂飼料30 d后檢測血清TC值，選擇TC值在5～10 mmol/L范圍內的大鼠分組。假手術組正常喂養(yǎng)。

1.5 分組及方法 將TC值在5～10 mmol/L范圍內的大鼠分為模型組、苯甲酸雌二醇組、六味地黃組。各組在繼續(xù)喂食高脂飼料的同時按上述分組給藥，苯甲酸雌二醇組:1.8×10－6g/kg，肌肉注射每3 d一次；六味地黃組:灌胃給藥6.75 g/kg，每天1次；正常組和模型組大鼠灌胃給予等容積的0.5%羧甲基纖維素鈉，每天一次，連續(xù)喂養(yǎng)11周。

1.6 血清和血漿標本的采集和指標檢測 實驗大鼠給藥11周后禁食12 h，正常飲水。用10%水合氯醛(劑量300 mg/kg)腹腔注射麻醉，頸動脈取血。室溫下靜置，待有血清析出時移至離心機中以3000 r/min離心10 min，分離出血清。按照相關試劑盒要求，采用酶標儀檢測血清中的TC、TG、LDL、HDL濃度，計算動脈粥樣硬化指數(shù)(Atherosclerosis index，AI)=(TC－HDL)/HDL。同時根據(jù)試劑盒要求頸動脈取血 1 mL 注入含有 10 μL 0.3 mol/L EDTA-Na2、10 μL 0.34 mol/L 8-羥基喹啉、5 μL 0.32 mol/L二巰基喹啉抗凝劑冰冷的抗凝管中的混勻，移至離心機中以4℃，2500 r/min離心15 min，分離出血漿。血漿標本和血清標本送北京華英生物技術研究所放免檢測E2、LH、FSH、AngⅡ。

1.7 子宮指數(shù)計算 大鼠頸動脈取血致死后，迅速分離子宮。在電子天平上稱量子宮濕質量，計算子宮指數(shù):子宮指數(shù)=子宮質量(mg)/大鼠體質量(g)。

1.8 主動脈HE染色 實驗大鼠頸動脈取血致死后立即沿胸主動脈上段同一部位取材，置于10%甲醛溶液中固定。逐級酒精脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片4 μm厚，HE染色觀察主動脈病變情況。

2 結果

2.1 六味地黃方對模型大鼠血脂的影響 模型組大鼠TC、TG、LDL-C水平和AI指數(shù)明顯升高，HDL-C水平明顯降低，與假手術組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。六味地黃方可以明顯降低TC、TG、LDL-C水平和AI指數(shù)，升高HDL-C水平，與模型組比較有差異或顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1 對模型大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響 ()

表1 對模型大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響 ()

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2.2 六味地黃方對模型大鼠子宮指數(shù)、E2、LH、FSH、AngⅡ水平的影響 模型組大鼠血清E2水平、子宮指數(shù)明顯降低，與假手術組有顯著性差異(P＜0.01)。六味地黃方有升高E2水平和子宮指數(shù)的趨勢，但升高幅度小于雌二醇組，且與模型組比較無顯著性差異。雌二醇組大鼠的E2水平、子宮指數(shù)明顯升高同時LH、FSH水平明顯降低，與模型組及六味地黃組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。六味地黃方可以明顯降低大鼠AngⅡ水平，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)。見表2。

2.3 光學顯微鏡觀察主動脈HE染色 見圖1。

表2 對模型大鼠子宮指數(shù)、E2、LH、FSH、AngⅡ的影響()

表2 對模型大鼠子宮指數(shù)、E2、LH、FSH、AngⅡ的影響()

注:六味地黃組與雌二醇組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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圖1 光學顯微鏡觀察主動脈HE染色

假手術組:組織學切片可見主動脈壁組織學結構正常，內皮細胞完整。彈力纖維分布均勻，排列整齊，未見異常改變。中膜平滑肌細胞排列整齊、均勻、厚度正常。

模型組:動脈內膜中度增厚，纖維輕度隆起，內皮細胞腫脹、變性、部分缺失；中膜增厚伴平滑肌細胞增生、胞體變大、排列紊亂，內膜及中膜均可見巨噬細胞。

E2組:動脈內膜內皮細胞腫脹、變性、部分缺失，動脈內膜未見增厚，中膜平滑肌細胞排列較正常，見少量泡沫細胞及脂質沉積。

六味地黃組:內膜內皮細胞完整、排列整齊，內彈力膜清晰完好，動脈內膜未見增厚，中膜平滑肌細胞排列較正常，見少量泡沫細胞及脂質沉積。

3 討論

婦女絕經(jīng)后卵巢功能減退，雌激素水平降低，引起血脂變化可引起脂質代謝紊亂，成為心血管疾病發(fā)生率增加的重要因素。近年來研究認為雌激素主要通過兩個作用環(huán)節(jié)影響血脂代謝。其一，雌激素降低總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白B，同時升高高密度脂蛋白膽固醇，改善血脂成分［7］，如果雌激素不足時，肝臟內膽固醇代謝酶的合成減少，從而影響了血脂代謝。其二，卵巢分泌雌激素減少導致下丘腦對雌激素負反饋作用削弱，引起體內促性腺激素的水平升高。在促性腺激素升高的同時，促腎上腺皮質激素的分泌也升高，這樣腎上腺皮質功能會有一定程度的亢進，引起體內膽固醇的升高［8］。血清中TC、TG及LDL-C水平升高和HDL-C水平下降是誘發(fā)動脈粥樣硬化的重要因素，其中LDL-C是動脈硬化的易患因子，其濃度與動脈硬化的發(fā)生率呈正相關。我們研究中發(fā)現(xiàn)雌性大鼠去卵巢復制動脈粥樣硬化模型后血脂水平比假手術組明顯升高，給予六味地黃湯以后TC、TG、LDL-C、AI指數(shù)顯著降低，HDL-C 顯著升高，主動脈病理HE染色顯示動脈粥樣硬化病變減輕，表明六味地黃方可通過降低更年期動脈粥樣硬化大鼠的血脂，升高HDL-C阻止更年期動脈粥樣硬化的發(fā)展。

許多證據(jù)表明，女性卵巢產(chǎn)生的雌激素對女性心血管系統(tǒng)有保護作用。Amparo等發(fā)現(xiàn)使用雌二醇可以阻止早期動脈粥樣硬化化形成［9］。在研究中我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的血清E2水平明顯下降，而LH、FSH水平有所升高。給予六味地黃方后E2水平和子宮指數(shù)均有升高的趨勢，但與模型組比較無顯著差異，推測六味地黃方可以部分改善雌性大鼠在切除雙側卵巢后雌激素分泌的情況。六味地黃方雖然可以升高雌激素水平，但升高的程度并不足以恢復至正常水平，說明六味地黃方可能不只是通過調節(jié)性腺軸的途徑減輕更年期動脈粥樣硬化的病變。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的活性過度增強是心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化形成與維持的一個重要原因，而AngⅡ是其中比較重要的成分。AngⅡ與動脈粥樣硬化的關系日益受到人們重視，它直接作用于血管壁引起血管收縮，促進SMC增殖及血管重構；刺激交感神經(jīng)、醛固酮等的分泌［10］。此外AngⅡ與高脂血癥具有協(xié)同作用，可以促使LDL氧化修飾為ox-LDL進而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生［11］。AngⅡ還可以誘導多種炎癥因子的表達，促進平滑肌細胞的增殖，參與動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展過程。有研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ的升高可以加速動物模型動脈粥樣硬化的形成［12］。目前尚沒有AngⅡ與更年期動脈粥樣硬化關系的報道，但是本研究中發(fā)現(xiàn)六味地黃方可以顯著降低去卵巢雌性大鼠AngⅡ水平，因此六味地黃方可能通過降低AngⅡ的水平阻止更年期動脈粥樣硬化的發(fā)生。

綜上所述，六味地黃方有改善更年期動脈粥樣硬化的作用，該作用與調節(jié)血清脂質水平，降低AngⅡ的作用有關，而六味地黃方改善性腺軸激素的作用不是其治療更年期動脈粥樣硬化的主要途徑。

［1］金 影，劉震坤.六味地黃湯治療更年期綜合征［J］.長春中醫(yī)藥大學學報，2010，26(5):738-739.

［2］Tuder RM，Petrache I，Elisa JA，et al.Apoptosis and emphysema:the missing link［J］.Am J Cell Mol Biol，2003，28:551-554.

［3］Makiuchi A，Yamaurak K，Mizuno S，et al.Hepatocyte growth factor prevents pulmonary ischemia-reperfusion injury in mice［J］.J Heart Lung Transplant，2007，26(9):935-943.

［4］王小紅，陳麗笙.六味地黃丸對絕經(jīng)前子宮切除術后卵巢功能及血脂的影響分析［J］.福建中醫(yī)學院學報，2005，15(4):15.

［5］焦亞斌，芮耀誠，楊鵬遠，等.動脈粥樣硬化大鼠主動脈IL-1β、TNF-α、IL-10及 IL-10R的表達及銀杏葉提取物的作用［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2005，26(2):158-160.

［6］姜 淼，卞慧敏，仇錦春，等.通塞脈片對動脈粥樣硬化模型大鼠的影響［J］.新中醫(yī)，2007，39(12):102-103.

［7］Wakatsuki A，Ikenoue N，Okatani Y，et al.Estrogen-induced small low density lipoprotein particles may be atherogenic in postmenopausal women［J］.J Am Coll Cardiol，2001，37:425-430.

［8］Angerer P，Stork S，Kothny W，et al.Effect of oral post-menopausal hormone replacement on progression of atherosclerosis:a ran-domized，controlled trial［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21:262-268.

［9］Villablanca A C，Tenwolde A，Lee M，et al.17β-estradiol prevents early-stage atherosclerosis in estrogen receptor-alpha deficient female mice［J］.J Cardiovasc Transl Res，2009，2:289-299.

［10］Carmeliet P.Angiogenesis in health and disease［J］.Nat Med，2003，9:653-660.

［11］余 靜，劉先哲.動脈粥樣硬化中血管緊張素Ⅱ對血管平滑肌細胞的作用［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2006，4(3):25-27.

［12］Weiss D，Kools JJ，Taylor WR.Angiotension Ⅱ induce hypertension accelerates the development of atherosclerosis in apoE-deficient mice［J］.Circulation，2001，103:448-454.