美洲大蠊中甘露醇的提取工藝研究

肖培云，楊永壽，李樹楠，契棲

(大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理671000)

蜚蠊為昆蟲綱蜚蠊目，蜚蠊科，俗稱蟑螂，全世界發(fā)現(xiàn)并記載的蟑螂種類3 000余種，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。蜚蠊作為藥用最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，目前被研究利用的主要為美洲大蠊(Periplaneta americana)，且以美洲大蠊為原料已開發(fā)出“康復(fù)新液”、“肝龍膠囊”、“心脈龍注射液”等系列新藥［1］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊中含有對肝炎、心血管疾病、肺癌及惡性纖維瘤有顯著療效的活性成分。經(jīng)研究該成分主要為多元醇、小分子多肽和黏糖氨酸。多元醇有自由基清除作用，用于治療病毒性心肌炎，爆震性耳聾，乙腦等［2］。甘露醇為多元醇化合物，文獻報道［3］可用比色法測定其含量，此法特異性較高，許多含羥基的物質(zhì)包括單糖等對其無明顯干擾，本實驗采用正交設(shè)計優(yōu)選美洲大蠊藥材中甘露醇的最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器UV2500紫外-可見分光光度計(日本島津儀器公司);AL204-IC電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);DZKW-4電子恒溫水浴鍋(上海科析試驗儀器廠);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHZ-ⅢA循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);SB5200DT超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司);DHG-9420A電子恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海-恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥美洲大蠊(批號20110415，由云南省大理彌渡美蠊養(yǎng)殖基地提供)，甘露醇標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號100533-200301)，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 Nash(乙酰丙酮)試液的配制稱取150 g醋酸銨，加適量蒸餾水溶解，再加入3 mL冰醋酸和2 mL乙酰丙酮，轉(zhuǎn)移至1 000 mL量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻。將配好的試劑儲存于棕色試劑瓶中，室溫放置12 h后保存于冰箱中備用(試液在最初的12 h內(nèi)顏色會變暗，故應(yīng)放置穩(wěn)定后再用)，配好的試液可在6～8周內(nèi)使用［4］。

2.1.2 0.015 mol/L高碘酸鉀溶液的制備精確稱取高碘酸鉀3.2 g，用0.12 mol/L HCl溶解并定容至1 000 mL，混勻，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備取烘干、粉碎過2號篩的美洲大蠊藥材500 g，于圓底燒瓶中，加適量石油醚，50～60℃水浴回流1 h進行脫脂處理，回收石油醚，藥渣于50～60℃烘干，備用。精稱脫脂后的美洲大蠊供試品10 g，置圓底燒瓶中，加蒸餾水80 mL，回流1 h，過濾，同法提取3次，合并濾液，減壓濃縮，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.4 標準品溶液的配制精密稱取干燥至恒質(zhì)量的甘露醇標準品10 mg，置10 mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準品貯備液。精密吸取甘露醇標準品貯備液4 mL于100 mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為40 μg/mL的標準品工作液。

2.2 測量波長的選擇分別取甘露醇標準液，供試液適量于25 mL量瓶中，加入1 mL 0.015 mol/L的高碘酸鉀溶液，室溫反應(yīng)10 min，加入4 mL新配制的Nash試劑，50℃水浴加熱15 min［4］，冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，混勻。用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描，結(jié)果顯示標準液和供試液在412 nm處均有最大吸收(見圖1)，因此確定本實驗的測量波長為412 nm［5］。歸，得回歸方程:Y=0.089X－0.441 7(r=0.999 1)。結(jié)果表明，甘露醇標準液在8～16 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度成良好的線性關(guān)系［5-6］。

圖1 藥材和對照品吸收光譜圖

2.3.2 精密度試驗精密吸取同一標準品溶液，按2.3.1項下方法顯色并測定吸光度，連續(xù)測定6次，吸光度值的RSD為0.15%，表明精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗精密稱取批號為20110415脫脂后的美洲大蠊供試品6份，每份10 g，按2.1.3項進行提取，再按

2.3.1 項方法測定吸光度，計算得供試品中甘露醇平均質(zhì)量分數(shù)為22.69 mg/g，RSD為1.5%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗精密稱取批號為20110415脫脂后的美洲大蠊供試品，按2.1.3制備得供試品溶液，再按2.3.1項方法顯色后每隔0.5 h測定1次，共測定7次，計算得甘露醇含量的RSD為1.95%，結(jié)果表明美洲大蠊中甘露醇的提取液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 甘露醇的提取工藝

2.4.1 提取方法的選擇精密稱取脫脂后的美洲大蠊供試品10 g，加60 mL水，分別采用索氏提取、回流提取、超聲提取的方法各提取1 h，過濾，定容至100 mL，按2.3.1項下方法測定甘露醇的含有量，結(jié)果見表1。

表1 提取方法的考察(n=3)

2.3 方法和結(jié)果

2.3.1 標準曲線的繪制精密吸取2.1.4項的甘露醇標準品工作液5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL，分別置25 mL量瓶中，加1 mL 0.015 mol/L的高碘酸鉀溶液混勻，室溫放置10 min，加4 mL新配制的Nash試劑，50℃水浴加熱15 min顯色，冷卻，于412 nm處測定吸光度值。以甘露醇標準液的質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，進行線性回

實驗結(jié)果表明，索氏提取的含量最高，回流提取的其次，超聲含量最低，考慮索氏提取和回流提取無顯著差異，而回流提取操作簡便，故采用回流提取法。

2.4.2 溶劑濃度的選擇精密稱取脫脂后的美洲大蠊供試品10 g，置圓底燒瓶中，按表2分別加入不同濃度的甲醇溶液60 mL，回流提取1 h，過濾，定容至100 mL，取適量顯色測定，并計算甘露醇的含有量，結(jié)果見表2。

表2 提取溶劑考察(n=3)

由表2可知，80%甲醇和水的提取效率無顯著差異，考慮到用甲醇提取毒性大且成本高，故本實驗選用蒸餾水做提取溶劑。

2.4.3 液固比考察精密稱取10 g脫脂后的美洲大蠊供試品6份，分別按表3精密加入蒸餾水，回流提取1 h，過濾，減壓濃縮，轉(zhuǎn)移至100 mL，定容。按照2.3.1項下測定甘露醇含有量。結(jié)果見表3。

表3 液固比考察(n=3)

結(jié)果表明，最佳液固比為1∶8，即10 g供試品加80 mL水進行提取。

2.4.4 正交試驗為了系統(tǒng)考察甘露醇的提取工藝，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇提取時間(A)、提取次數(shù)(B)、液固比(C)作為考察因素，各取3水平。因素水平見表4。

表4 因素水平

按正交設(shè)計表L9(34)安排試驗，實驗結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表5 正交試驗結(jié)果

表6 方差分析結(jié)果

通過綜合評價，各因素對甘露醇提取的影響順序為B＞C＞A。即提取次數(shù)對甘露醇的影響較顯著，提取時間，液固比的影響都不顯著。甘露醇提取的最佳因素水平組合為A2B3C3，由于提取時間影響較小，從節(jié)約能源考慮，最佳提取工藝如下:回流1 h，提取3次，液固比1∶8。

2.4.5 驗證性試驗精稱脫脂后的美洲大蠊供試品3份，每份10 g，按最佳提取工藝A1B3C3提取，按2.3.1項下方法測定，計算甘露醇平均質(zhì)量分數(shù)為22.72 mg/g，與正交試驗中含量最高的相接近，表明該提取工藝穩(wěn)定、合理、可行性強。結(jié)果見表7。

表7 驗證性試驗

3 討論

美洲大蠊為動物藥，油脂含量較高，對甘露醇的提取干擾較大，因此實驗中考察了脫脂的方法。方法一:將藥材提取濃縮成浸膏，加沸水溶解，放置冰箱冷藏過夜，過濾，濾液定容至100 mL，備用。該方法過濾速度很慢，損失大，實驗結(jié)果的重復(fù)性差，溶液顏色較深，對測定有干擾。方法二:用石油醚回流萃取油脂，加入適量石油醚回流1 h，過濾，回收石油醚，藥渣低溫干燥，備用。該方法脂肪去除完全，過濾速度快，可大大節(jié)省實驗時間，實驗結(jié)果的重復(fù)性好。

《中國藥典》2010版二部中甘露醇的含量測定方法是容量法［7］，該法是用氧化劑滴定甘露醇中的醇羥基。樣品中含有糖類及其他還原性物質(zhì)對該方法有干擾，美洲大蠊中含有大量的糖類物質(zhì)［8］，故該方法不適合于美洲大蠊中多元醇的測定［9］。

紫外-可見分光光度法測定甘露醇的原理是:在一定條件下，甘露醇與高碘酸鉀反應(yīng)生成黃色的3，5二乙酰-1，4脫氫二甲基吡啶，此化合物在412 nm處有最大吸收。

將半乳糖、葡萄糖、甘露糖等單糖制成50 μg/mL的溶液，用2.2項方法顯色，掃描吸收曲線，結(jié)果各單糖在掃描波長內(nèi)未見吸收，證明上述單糖對甘露醇的測定無干擾［10-12］。

該實驗用到的顯色劑為乙酰丙酮，見光會易分解，應(yīng)貯藏于棕色瓶中。

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