朱砂安神丸定量指紋圖譜可靠度研究

孫國祥， 尹 霞

（沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

朱砂安神丸(ZSASW)來源于李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，每丸含0.9 g朱砂，1.35 g黃連，0.9 g地黃，0.9 g當(dāng)歸和0.45 g甘草，有清心養(yǎng)血，鎮(zhèn)驚安神之功效，常用于心火上炎，熱傷陰血所致的胸中煩熱，心悸不寧，失眠多夢(mèng)等［1］。文獻(xiàn)有測(cè)定朱砂安神丸中硫化汞和小檗堿及指紋圖譜研究［2-3］。本實(shí)驗(yàn)建立朱砂安神丸指紋譜并評(píng)價(jià)其可靠度，實(shí)現(xiàn)對(duì)化學(xué)指紋數(shù)量分布、含有量分布比例和整體含有量差異評(píng)價(jià)時(shí)具有的可靠度，成為中藥指紋圖譜鑒定中藥質(zhì)量的再評(píng)價(jià)方法。

1 對(duì)照指紋圖譜可靠度評(píng)價(jià)［4-5］

由10批以上代表性樣品指紋譜按均值法計(jì)算生成對(duì)照指紋圖譜(RFP)必然產(chǎn)生不確定度。系統(tǒng)指紋定量法(SQFM)是根據(jù)宏定性相似度Sm(SF和S'F均值)和宏定量相似度Pm(P和C均值)及指紋變異系數(shù)α來整體監(jiān)測(cè)樣品化學(xué)指紋總體含量。中藥對(duì)照指紋圖譜是m批樣品指紋平均模式(Sm=1，Pm=100%，α=0)，分別用 m 批樣品 SF，S'F'，C，P標(biāo)準(zhǔn)偏差除即為不確定度見(1)式。把1扣除不確定度后得對(duì)照指紋譜宏定性可靠度SR見(2)式和宏定量可靠度PR見(3)式，二者越接近1表明對(duì)照指紋圖譜越可靠。

2 單批指紋圖譜可靠度評(píng)價(jià)［6-8］

單批指紋譜不確定度決定于指紋均化性變動(dòng)系數(shù)α，見(4)式，依據(jù) f，r，C，P得定性不確定度Ufj、比率定性不確定度Urj、投影含量不確定度UCj和等權(quán)含量不確定度UPj。把1扣除單批不確定度分別得到單批宏定性可靠度SRj見(5)式和單批宏定量可靠度PRj見(6)式，二者越接近1越可靠。SQFM和可靠度R劃分標(biāo)準(zhǔn)見表1、表2。

表1 中藥質(zhì)量等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)及其可靠度標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Division criteria for quality grade of traditional Chinese medicine

表2 中藥質(zhì)量等級(jí)的不確定度和可靠度的定性劃分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Qualitative division criteria of uncertaninty and reliability for quality grade of traditional Chinese medicine

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 儀器和試劑 Agilent 1100型液相色譜儀(美國 Agilent)；小 檗 堿 (berberine，BBR，批 號(hào)20080717)、5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，5-HMF，批號(hào)111626-200503)與阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A，批號(hào)0773-9910)對(duì)照品，由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純；12批市售朱砂安神丸，編號(hào)S1～S12，均購自沈陽各藥店。

3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取小檗堿對(duì)照品12.5 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。同法配制500 μg/mL阿魏酸和1 mg/mL 5-羥甲基糠醛對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液制備 取朱砂安神丸1丸，剪碎，精密稱定，加甲醇50 mL，回流提取1 h，過濾，藥渣加甲醇50 mL再回流1 h，合并濾液，減壓濃縮至約16 mL，再用甲醇定容至25 mL，搖勻，作供試液。

3.4 色譜條件［3］Century SIL C18BDS柱 (200 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相 A 為 0.2%H3PO4溶液，B為0.1%H3PO4乙腈溶液。梯度程序:0～10 min，0% ～15%B；10～30 min，15% ～30%B；30 ～50 min，30% ～70%B；50 ～60min，70% ～85%B。體積流量1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長265 nm，柱溫(30 ±0.15)℃，進(jìn)樣量 5 μL，洗脫時(shí)間為 66 min。

4 結(jié)果與討論

4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取各對(duì)照品溶液，以及供試品溶液各5 μL，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖見圖1。比較保留時(shí)間和在線紫外光譜確定8、24和34號(hào)峰分別為5-羥甲基糠醛、阿魏酸和小檗堿。選34號(hào)峰作參照物峰，測(cè)得理論板數(shù)應(yīng)不小于11600。

圖1 對(duì)照品和樣品S1的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of references and S1 sample

4.2 方法學(xué)考察 以34號(hào)峰(小檗堿)保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，精密度試驗(yàn)時(shí)各共有峰相對(duì)峰面積RSD均小于4.0%；穩(wěn)定性試驗(yàn)時(shí)各共有峰相對(duì)峰面積RSD均小于4.0%；重復(fù)性試驗(yàn)時(shí)各共有峰相對(duì)峰面積的RSD均小于4.0%。結(jié)果表明方法精密度和重現(xiàn)性良好，在24 h內(nèi)樣品基本穩(wěn)定。

4.3 指紋圖譜建立和質(zhì)量評(píng)價(jià)［10-11］測(cè)定12批朱砂安神丸指紋圖譜見圖2，確定55個(gè)共有峰，以12批樣品譜按均值法生成準(zhǔn)對(duì)照指紋譜并計(jì)算各樣品Sm和 Pm，聚類分析得 S1～S6和 S9～S12為第Ⅰ類，S7和S8為第Ⅱ類。選取第Ⅰ類按均值法生成RFP見圖2，重新評(píng)價(jià)12批樣品見表3，結(jié)果 S1、S2、S3和S4質(zhì)量極好，S6、S9、S10和S12質(zhì)量很好，S5和S11質(zhì)量好，而S7和S8質(zhì)量劣。

圖2 12批朱砂安神丸HPLC指紋譜Fig.2 HPLC fingerprints of twelve batches of Zhusha Anshen Pill

表3 12批朱砂安神丸質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.3 Quality identifying results of twelve batches of Zhusha Anshen Pill

4.4 朱砂安神丸-HPLC-RFP可靠度［12-13］計(jì)算朱砂安神丸對(duì)照譜不確定度和可靠度為Uf=0.001，Ur=0.022，US=0.011，SR=0.989；UC=0.032，UP=0.026，UM=0.021，PR=0.979；其宏定性可靠度SR＞0.98表明RFP反映的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量和含有量分布比例的可靠性很高。其宏定量可靠度PR＞0.97，表明用RFP定量評(píng)價(jià)時(shí)具有很高可靠性。

4.5 12批朱砂安神丸-HPLC指紋譜可靠度［14-15］計(jì)算12批朱砂安神丸指紋譜不確定度見表4，結(jié)果S7和S8定性定量不確定度較高，其定性定量可靠度較低，說明此2個(gè)樣品代表的指紋數(shù)量分布和含有量分布及整體含有量可靠度較低。其它10批朱砂安神丸定性定量可靠度均大于0.96，表明各批指紋譜反映的化學(xué)指紋數(shù)量和含有量分布比例及整體含有量的可靠度很高。

表4 12批樣品不確定度和可靠度結(jié)果Tab.4 Results of uncertainity and reliability of twelve batches of sample

5 結(jié)論

對(duì)中藥對(duì)照指紋圖譜和單批指紋譜可靠度進(jìn)行研究，對(duì)朱砂安神丸HPLC指紋譜可靠度評(píng)價(jià)，結(jié)果宏定性和宏定量可靠度均大于0.97，表明對(duì)照指紋譜具有準(zhǔn)確可信特點(diǎn)。采用SQFM評(píng)價(jià)朱砂安神丸質(zhì)量，對(duì)12批指紋譜所代表質(zhì)量進(jìn)行可靠度評(píng)價(jià)表明質(zhì)量等級(jí)和可靠度無相關(guān)性。單批指紋譜可靠度僅是對(duì)鑒定結(jié)果可靠與否的評(píng)判，可靠度越大表明結(jié)果可信性越高。指紋譜定性定量不確定度是衡量指紋譜表達(dá)中藥質(zhì)量時(shí)所產(chǎn)生的不準(zhǔn)確性尺度，指紋譜可靠度是衡量指紋圖譜宏觀定性定量鑒定中藥質(zhì)量結(jié)果可靠度的度量。本方法是中藥指紋圖譜評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的再評(píng)價(jià)。

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