銀翹解毒液1H-NMR指紋圖譜研究

姜苗苗， 張 宇， 馮毅凡

（廣東藥學院中心實驗室，廣東 廣州 510006）

中藥指紋圖譜是目前能夠為國內外廣泛接受的一種中藥質量評價模式。1H-NMR作為一種波譜型指紋圖譜與傳統(tǒng)色譜型指紋圖譜相比，在將復方中藥體系中所有有效成分盡可能多的表現(xiàn)出來方面，具有全面性和整體性的優(yōu)勢［1-3］。由于1H-NMR中質子信號峰與樣品中各個化合物的氫原子一一對應，因此1H-NMR指紋圖譜是一種表達復方中藥體系的合適的整體表征模式。此外，1H-NMR指紋圖譜無須樣品預處理，可避免色譜分離造成的成分損失，同時不會破壞樣品的結構和性質［4］，適合于中藥口服液類樣品的快速檢識。銀翹解毒液作為常用清熱解毒類非處方中藥口服液，主要由金銀花、連翹、桔梗、淡竹葉、牛蒡子、薄荷、荊芥、淡豆豉和甘草九味中藥材組成［5］，目前尚無其指紋圖譜研究的相關報道。本實驗首次建立了銀翹解毒液的1H-NMR指紋圖譜，為其質量評價和質量控制提供一種全面、有效、快速可行的檢測方法。

1 儀器與試藥

BRUKER AVANCEⅢ500型超導核磁共振波譜儀，質子激發(fā)頻率500.13 MHz，配置BBFO正相觀察寬帶探頭和BVT3200數(shù)字控溫儀。美國Wilmad WG-5000核磁樣品管。D2O氘代度＞99.8%，美國Norell公司。實驗用10批銀翹解毒液(110101，110201，110203，110302，110305，110402，110502，110602，110605，110606)購自廣東華南藥業(yè)有限公司。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的配置

精密移取銀翹解毒液樣品450 μL，轉移至5 mm核磁管中，并加入50 μL D2O，混合均勻后將核磁管加封直接用于1H-NMR測試。

2.2 1H-NMR測試條件

測定溫度298 K；觀測頻率500.13 MHz；譜寬10330.58 Hz；90°脈沖寬度 14.50 μs；采樣數(shù)據(jù)點65536；掃描次數(shù)32次；延遲時間6 s；混合時間0.1 s；接受增益128。

2.3 1H-NMR指紋圖譜的測定

供試品溶液在500 MHz核磁共振儀上采用Topspin 2.0軟件系統(tǒng)進行操控測試，以90%H2O+10%D2O鎖場，使用預飽和脈沖序列NOESYGPPR1D在δ4.7處壓制水峰，在2.2項的測試條件下測定1H-NMR圖譜，得到一組FID信號。經(jīng)過傅里葉變換、窗函數(shù)擬合、相位與基線校正，并用蔗糖端基質子信號定標后，得到1H-NMR指紋圖譜。

2.4 圖譜與分析數(shù)據(jù)的處理

應用MetresNova軟件在δ 0～9.0范圍進行分段積分，以0.04為最小間隔積分，得到224個數(shù)據(jù)點，即每段化學位移值下的相對峰面積積分值，并建立Excel數(shù)據(jù)庫。根據(jù)相似度計算原理，利用Excel 2003軟件進行相似度分析。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度實驗 取同一份銀翹解毒液供試品溶液，在上述1H-NMR測試條件下連續(xù)6次測定指紋圖譜，用2.3項下的方法處理圖譜，得到一系列相對峰面積積分值。計算6組數(shù)據(jù)之間的相關系數(shù)和夾角余弦值，結果均在0.99以上，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性實驗 取同一批次銀翹解毒液供試品溶液6份，測試1H-NMR指紋圖譜，計算6組數(shù)據(jù)相對峰面積積分值之間的相關系數(shù)和夾角余弦值，結果均在0.99以上，表明該方法的重復性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實驗 取同一份銀翹解毒液供試品溶液，分別在 0、4、8、12、16、20 h 測試1H-NMR 指紋圖譜，計算6組數(shù)據(jù)相對峰面積積分值之間的相關系數(shù)和夾角余弦值，結果均在0.99以上，表明供試品溶液在常溫實驗條件下穩(wěn)定性良好。

2.6 指紋圖譜相似度分析

按2.1項下方法將10批銀翹解毒液樣品制備成供試品溶液，采用2.2、2.3和2.4項下方法測定和處理指紋圖譜。10批樣品的1H-NMR指紋圖譜見圖1。

圖1 10批銀翹解毒液1H-NMR指紋圖譜Fig.1 1H-NMR fingerprint for ten batches of Yinqiao Jiedu Liquid

分別選擇平均矢量和中位數(shù)矢量作為對照指紋圖譜，計算10批樣品的相關系數(shù)和夾角余弦值，結果10批銀翹解毒液樣品中有8批樣品的相關系數(shù)和夾角余弦相似度在0.97以上，另外2批樣品差異性較大，相似度在0.82～0.91之間。見表1。

表1 10批銀翹解毒液相似度分析計算結果Tab.1 Evaluation of similarities on ten batches of Yinqiao Jiedu Liquid

3 討論

3.1 水峰壓制技術

在常規(guī)1H-NMR譜測試中口服液中的水峰質子信號非常強，常常掩蓋了樣品組分信號峰，因此有效的水峰抑制是測定口服液指紋圖譜中的重要問題。我們分別采用預飽和單脈沖(1D sequence with f1 presaturation，ZGPR)、反相梯度預飽和單脈沖(1D sequence with presaturation using composite pulse and spoil gradient，ZGCPGPPR)、通過 T1作用增強的水峰抑制(WET solvent suppression with shape pulse，WET)和弛豫延遲和混合時間的預飽和梯度脈沖(with presaturation during relaxation delay and mixing time and spoil gradient，NOESYGPPR1D)4 種水峰抑制方法采集銀翹解毒液的1H-NMR指紋圖譜。所得的1H-NMR指紋圖譜表明(圖2)，4種方法對水峰抑制效率各不相同。其中NOESYGPPR1D抑制水峰效率最高，譜基線平整，改善了低濃度組分的信噪比和分辨率，因此本實驗選擇NOESYGPPR1D為1HNMR指紋圖譜制譜過程中關鍵脈沖序列。

圖2 4種脈沖序列下的銀翹解毒液1H-NMR指紋圖譜Fig.2 1H-NMR fingerprints of Yinqiao Jiedu Liquid acquired by four different pulse programs

3.2 指紋圖譜特征分析與評價

銀翹解毒液樣品的1H-NMR信號峰分布在δ 0～9.0之間，主要分為三個特征區(qū)域:δ 0～3.0的飽和脂肪區(qū)、δ 3.0～5.5的糖基質子區(qū)以及δ 5.5～9.0的芳香區(qū)(圖3)。低場區(qū)δ 5.5～9.0的芳香質子信號主要來自金銀花中綠原酸等咖啡酰類有機酸和黃酮類成分［6］，連翹中苯乙醇苷和木脂素類成分［7］，淡竹葉中的黃酮［8］，牛蒡子中的木脂素［9］以及其他藥材中大量帶苯環(huán)的化合物。δ 3.0～5.5的質子信號主要來自口服液中的蔗糖和糖苷類化合物。高場區(qū)δ 0～3.0的飽和質子信號主要來源于連翹和桔梗中的三萜類成分［7，10］以及薄荷中薄荷醇等單萜類揮發(fā)油［11］等成分。根據(jù)上述分析，考察了藥材陰性對照液與銀翹解毒液的相關性(圖4)，發(fā)現(xiàn)在銀翹解毒液的1H-NMR指紋圖譜中，芳香區(qū)和飽和脂肪區(qū)范圍的質子信號表征了其的主要成分特征及相對比例，而中藥制劑的化學成分及其比例差異性則反應了其質量的變化。

圖3 銀翹解毒液樣品1H-NMR圖譜的指紋分析Fig.3 Fingerprinting analyses for typical1H-NMR spectrum of Yinqiao Jiedu Liquid

圖4 藥材陰性對照液與銀翹解毒液相關性考察Fig.4 Relationship between negative control solutions of herbs and Yinqiao Jiedu Liquid

本實驗對10批銀翹解毒液指紋圖譜進行研究，其相關系數(shù)和夾角余弦值的相似度計算結果顯示:不同批次樣品指紋圖譜主要峰群的整體面貌基本一致，但是在化學位移和相對積分面積值方面存在一定的差異，2批樣品與其他8批樣品的相似度相差較大，提示其質量的一致性和穩(wěn)定性有所差異。另外，我們考察了市售銀翹解毒液和同類產(chǎn)品銀翹解毒合劑［12］的1H-NMR指紋圖譜(圖5)，盡管二者的藥材成分相同，但其芳香區(qū)和飽和脂肪區(qū)質子信號具有明顯差異，進一步說明該方法對樣品測定的專屬性有合理的鑒定。

本實驗所建立的1H-NMR指紋圖譜法穩(wěn)定性高，精密度好，重現(xiàn)性佳，且分析速度快，同時全面表征了中藥復方制劑中的多種復雜化學成分，化學位移對應的相對峰面積積分值也可以反應出化學成分之間的相對比例，因此本研究可以為市售銀翹解毒液的質量評價以及質量標準的制定提供依據(jù)。

圖5 銀翹解毒液與銀翹解毒合劑1H-NMR圖譜Fig.5 1H-NMR spectra of Yinqiao Jiedu Liquid and Yinqiao Jiedu Mixture

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