調(diào)免毓麟湯對(duì)免疫性不育大鼠精液酸性磷酸酶、抗精子抗體及合籠后雌鼠妊娠率的影響

舒勁松，曹繼剛，周安方，黃瓊霞，董德河

（湖北中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065）

免疫性不育的臨床診斷主要以血清或（和）精漿中發(fā)現(xiàn)抗精子抗體（AsAb）為依據(jù)，多伴有腰膝酸軟、耳鳴等癥狀或有生殖道感染、性腺損傷、輸精管堵塞等病史［1］。存在于正常人精漿中的精漿免疫抑制物（seminal plasma immunoinhibition material，SPIM）能遮蔽和改變精子抗原，抑制局部和全身的細(xì)胞、體液免疫反應(yīng)，維護(hù)正常的生殖生理過程。有研究表明，人精液酸性磷酸酶（ACP）是人精液中的免疫抑制物的主要成分之一，其減少時(shí)可能會(huì)引起AsAb的產(chǎn)生。根據(jù)《實(shí)用男科疾病診斷治療學(xué)》［2］及《臨床疾病診斷依據(jù)治愈好轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)》［3］制定的免疫性不育治療效果標(biāo)準(zhǔn)——AsAb轉(zhuǎn)陰是治療免疫性不育的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)大鼠精液ACP活性，觀察調(diào)免毓麟湯對(duì)模型大鼠的AsAb轉(zhuǎn)陰率以及與配對(duì)雌鼠合籠后的胚胎數(shù)和妊娠率等指標(biāo)，探討調(diào)免毓磷湯抑制AsAb的產(chǎn)生及生殖系統(tǒng)免疫反應(yīng)的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

3月齡SD雄性大鼠120只，雌性70只，體重（280±20）g。購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物

調(diào)免毓麟湯（熟地、巴戟天、蒲公英、敗醬草、丹參、川牛膝、甘草等組成），由湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬門診部制成水煎劑，臨用時(shí)用蒸餾水配成低、中、高三種不同的濃度，即1.04、2.08、4.16g／mL；醋酸強(qiáng)的松片，江西國(guó)藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：0604041，臨用時(shí)研末用蒸餾水配成0.0324g／mL的混懸液。

1.3 試劑與儀器

酸性磷酸酶（ACP）試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供。其組成為：緩沖液、基質(zhì)液、堿液、顯色劑、酶標(biāo)準(zhǔn)貯備液，臨用時(shí)酶標(biāo)準(zhǔn)貯備液按1：10與蒸餾水配制成0.1 mg／mL的酶標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液?？咕涌贵w酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）試劑盒，由華美生物工程公司提供。試劑盒內(nèi)組分有：預(yù)包被板，樣品反應(yīng)液，陰性對(duì)照液，陽性對(duì)照液，清洗液，酶結(jié)合物，顯色液A，顯色液B，終止液。

1.4 造模與給藥

參照張淑芹等［1］方法，將60只雄性大鼠采用同種異體抗原進(jìn)行主動(dòng)免疫，復(fù)制免疫性不育大鼠模型。第3次加強(qiáng)免疫后共有57只大鼠血清AsAb為陽性，2只大鼠血清AsAb為陰性，1只死亡。

大鼠造模前隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照組，并將57只AsAb陽性雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組11只、醋酸強(qiáng)的松組11只、調(diào)免毓麟湯低劑量組11只、調(diào)免毓麟湯中劑量組12只、調(diào)免毓麟湯高劑量組12只。正常組及模型組灌胃生理鹽水，其余各組灌胃相應(yīng)藥2mL／只，每日1次，連續(xù)30天。

1.5 取材與制備

各組雄鼠在灌胃給藥第30天，按照文獻(xiàn)［4］進(jìn)行大鼠采精實(shí)驗(yàn)。抗原的制備：每次免疫前取3月齡雄性SD大鼠12只，急性斷頭處死后取雙側(cè)附睪，用生理鹽水沖洗，置于10mLM199獲能液中，剪碎，37℃靜置15min，尼龍網(wǎng)（孔徑200μm）過濾，37℃培育1.5h，加PBS溶液調(diào)精子數(shù)為2.8×106／mL，加入完全福氏佐劑10mL，研磨混勻作為抗原。又分別于灌胃給藥第10天、第20天、第30天斷尾取血10μL，分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測(cè)血清AsAb；停藥后，各組雄鼠與雌鼠合籠1周，每只雄鼠與1只雌鼠配對(duì)，從合籠次日起每天上午9：00-10：30作陰道涂片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 調(diào)免毓麟湯對(duì)免疫性不育大鼠精液ACP活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠精液ACP活性顯著下降，與正常組比較有極顯著性差異（P＜0.01）；各治療組大鼠精液ACP活性較之模型組有所上升，醋酸強(qiáng)的松組大鼠精液ACP活性與調(diào)免毓麟湯低劑量組比較差異不顯著（P＞0.05），與調(diào)免毓麟湯中、高劑量組比較有極顯著性差異（P＜0.01）；調(diào)免毓麟湯中、高劑量組間比較差異不顯著（P＞0.05）。見表1。

表1 調(diào)免毓麟湯對(duì)免疫性不育大鼠精液ACP活性的影響（）

表1 調(diào)免毓麟湯對(duì)免疫性不育大鼠精液ACP活性的影響（）

注：與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與醋酸強(qiáng)的松組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與調(diào)免毓麟湯低劑量組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

組別 n ACP（U／mL）10 63.93±14.89模型組 11 39.09±8.96△△醋酸強(qiáng)的松組 11 48.90±10.05△△★調(diào)免毓麟湯低劑量組 11 48.16±10.36△△★調(diào)免毓麟湯中劑量組 12 56.07±10.48★★▲▲◇調(diào)免毓麟湯高劑量組 12 57.48±10.56正常組★★▲▲◇

2.2 調(diào)免毓麟湯對(duì)免疫性不育大鼠血清AsAb的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療第10天，各治療組轉(zhuǎn)陰率比較差異不顯著（P＞0.05）；治療第20天，各治療組轉(zhuǎn)陰率比較差異不顯著（P＞0.05）；治療第30天，調(diào)免毓麟湯各劑量組與醋酸強(qiáng)的松組比較有顯著性差異（P＜0.05），調(diào)免毓麟湯各劑量組之間比較差異不顯著（P＞0.05）。見表2。

表2 調(diào)免毓麟湯對(duì)免疫性不育大鼠血清AsAb的影響 ［n（%）］

2.3 調(diào)免毓麟湯對(duì)免疫性不育大鼠合籠后雌鼠妊娠率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組配對(duì)雌鼠有2只妊娠，其中有1只雌鼠在妊娠第11天流產(chǎn)；調(diào)免毓麟湯各劑量組妊娠率、每胎胚胎數(shù)均高于醋酸強(qiáng)的松組和模型組，調(diào)免毓麟湯各劑量組與模型組、醋酸強(qiáng)的松組比較有顯著性差異（P＜0.01）；醋酸強(qiáng)的松組與模型組比較差異不顯著（P＞0.05）。提示調(diào)免毓麟湯能顯著提高雌鼠妊娠率、每胎胚胎數(shù)。此外，還觀察到醋酸強(qiáng)的松組雄鼠毛欠光澤，不柔順，飲食減少，體重下降，可能是醋酸強(qiáng)的松的副作用所致。由此推測(cè)，醋酸強(qiáng)的松的副作用可能是影響雌鼠妊娠率、每胎胚胎數(shù)的原因之一。見表3。

表3 調(diào)免毓麟湯對(duì)免疫性不育大鼠合籠后雌鼠妊娠率的影響（）

表3 調(diào)免毓麟湯對(duì)免疫性不育大鼠合籠后雌鼠妊娠率的影響（）

注：與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與醋酸強(qiáng)的松組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與調(diào)免毓麟湯低劑量組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

10 10 100.0 131 13.1±1.5模型組 11 2 18.2△△ 8 4.0±1.4△△醋酸強(qiáng)的松組 11 4 36.4△△ 18 4.6±2.3△△調(diào)免毓麟湯低劑量組 11 9 81.8★★▲▲ 108 12.0±2.0★★▲▲調(diào)免毓麟湯中劑量組 12 11 91.7★★▲▲ 129 11.7±3.4★★▲▲調(diào)免毓麟湯高劑量組 12 11 91.7★★▲▲ 133 12.1±1.7總胚胎數(shù) 每胎胚胎數(shù)正常組組別 n 妊娠雌鼠數(shù) 妊娠率（%）★★▲▲

3 討論

SPIM是存在于精液中的一組物質(zhì)，通過封閉精子膜特異性抗原位點(diǎn)，或者通過對(duì)各種免疫細(xì)胞的抑制作用，使精子免受免疫細(xì)胞的進(jìn)攻，從而保護(hù)精子，使得自身不產(chǎn)生免疫反應(yīng)；ACP是人精液中的免疫抑制物的主要成分之一，其減少時(shí)可能會(huì)引起AsAb的產(chǎn)生。AsAb對(duì)精子膜固有成分及膜表面被覆成分的結(jié)合，不僅可以干擾精子的代謝及獲能過程，影響精子的存活，導(dǎo)致精子凝集，活力下降；而且表面帶有AsAb的精子，難以穿透宮頸粘液，從而降低受精部位的精子數(shù)；此外，AsAb還可干擾受精過程，甚至影響受精卵的分裂和植入以及胚胎的存活，導(dǎo)致流產(chǎn)和不育。本實(shí)驗(yàn)中模型組配對(duì)雌鼠只有2只妊娠，其中1只雌鼠在妊娠第11天流產(chǎn)，說明AsAb可通過不同的環(huán)節(jié)和機(jī)制影響精子的功能，干擾受精過程，而致流產(chǎn)和不育。

由于腎上腺皮質(zhì)激素既有抗炎作用，又可影響抗原的合成，抑制AsAb和補(bǔ)體介導(dǎo)的精子細(xì)胞毒性，因而被西醫(yī)用作治療男性免疫性不育的常用藥物，但長(zhǎng)期或大劑量使用副作用大［5］。調(diào)免毓麟湯治療作用在于扶正祛邪，扶正是調(diào)整機(jī)體的免疫功能，祛邪則是排除破壞免疫平衡的因素，從而達(dá)到新的平衡，同時(shí)調(diào)節(jié)全身免疫系統(tǒng)來消除As-Ab，使免疫功能恢復(fù)正常，且未見副作用。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠精液ACP活性明顯下降，很可能是精液參數(shù)各項(xiàng)指標(biāo)下降，誘導(dǎo)AsAb產(chǎn)生，導(dǎo)致不育的重要原因。醋酸強(qiáng)的松組大鼠出現(xiàn)的毛欠光澤、不柔順、飲食減少、體重下降等情況，可能是醋酸強(qiáng)的松的副作用所致。治療第30天，調(diào)免毓麟湯各劑量組AsAb轉(zhuǎn)陰率顯著高于醋酸強(qiáng)的松組；調(diào)免毓麟湯各劑量組妊娠率和每胎胚胎數(shù)均高于模型組和醋酸強(qiáng)的松組。由此可知，調(diào)免毓麟湯對(duì)免疫性不育的治療作用可能是通過提高精液ACP活性，從而抑制AsAb的產(chǎn)生，提高生育力。

［1］陳如鉤.不孕不育治療學(xué)［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1997：144.

［2］郭瑞林.實(shí)用男科疾病診斷治療學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，1994：74.

［3］孫傳興.臨床疾病診斷依據(jù)治愈好轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，1999：464

［4］鄭新民，李聚學(xué)，魏雁，等.小鼠采精方法的研究［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2005，15（2）：88-91.

［5］黃宇鋒，許瑞吉.男科診斷學(xué)［M］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，1999：85-86.