GPR41穩(wěn)定細(xì)胞株的建立及受體激動(dòng)劑篩選

吳 瑨， 董素珍

（華東師范大學(xué) 腦功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、上海市腦功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062）

0 引 言

GPR40家族包含4個(gè)成員（GPR40、GPR41、GPR42和GPR43），該家族在人、小鼠及大鼠等物種間的氨基酸序列高度保守［1］.其中GPR41的表達(dá)分布較為廣泛，在脂肪組織中的表達(dá)量最高，在單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中也有表達(dá)［2］.自1997年發(fā)現(xiàn)GPR41受體以來(lái)，因未發(fā)現(xiàn)其配體故GPR41一直被歸為孤兒GPCR.直到2003年，Brown等人發(fā)現(xiàn)GPR41的配體是短鏈脂肪酸［3］.短鏈脂肪酸是指碳原子數(shù)小于6個(gè)的有機(jī)脂肪酸，乙酸鹽（C2）、丙酸鹽（C3）和丁酸鹽（C4）是最主要的短鏈脂肪酸，主要由食物中不被消化的碳水化合物經(jīng)厭氧菌酵解生成，為胃腸道上皮細(xì)胞提供了主要的能量來(lái)源［2］.短鏈脂肪酸除了作為能量來(lái)源，還可以參與誘導(dǎo)細(xì)胞分化和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等生理現(xiàn)象.GPR41的去孤兒化，促使人們重新思考短鏈脂肪酸在體內(nèi)發(fā)揮作用的方式.已有研究表明GPR41參與調(diào)節(jié)瘦素的分泌，這表明GPR41可參與能量代謝過(guò)程［4］.鑒于GPCRs在制藥領(lǐng)域占有極其重要的地位，對(duì)于創(chuàng)新藥物研究意義重大，而且目前對(duì)GPR41的配體篩選以及功能所知甚少，因此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了GPR41穩(wěn)定細(xì)胞株，用于篩選GPR41的激動(dòng)劑或拮抗劑.

在現(xiàn)代藥物研究中，天然產(chǎn)物的開發(fā)和利用占據(jù)著重要的位置.而海洋資源的開發(fā)逐漸成為熱點(diǎn)，因?yàn)楹Ｑ蟓h(huán)境具有高鹽、高壓、低溫等特點(diǎn)，海洋生物為了適應(yīng)這樣獨(dú)特的生存環(huán)境，漸漸進(jìn)化出了與之相適應(yīng)的代謝系統(tǒng)和機(jī)體防御系統(tǒng).在海洋生物及其代謝產(chǎn)物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多新穎的生物活性物質(zhì)，如抗腫瘤藥物、生物毒素、酶抑制劑、抗病毒化合物以及抗菌素等［5］.在海洋生物資源中，海洋真菌具有種類繁多、分布廣泛、次級(jí)代謝產(chǎn)物量大、生物活性物質(zhì)種類豐富等特點(diǎn)，研究海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物逐漸成為開發(fā)海洋藥物資源的重要內(nèi)容.將GPR41受體穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型用于篩選從福建莆田平海灣海藻來(lái)源的黃曲霉c－f－3（Aspergillusflavus）中提取到的次級(jí)代謝產(chǎn)物.通過(guò)cAMP檢測(cè)法對(duì)上述單體化合物進(jìn)行受體結(jié)合活性的篩選，希望能夠找到GPR41潛在的受體激動(dòng)劑，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

人類基因組DNA、DNA連接試劑盒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Taq酶、脫氧三磷酸核苷酸（dNTP）、限制性內(nèi)切酶和Trizol試劑購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒及核酸片段純化試劑盒、Western顯影用BCIP／NBT顯影液購(gòu)自Promega公司；RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素和G418購(gòu)自Gibco公司；Blasticidin和兔抗c－Myc多克隆抗體購(gòu)自Sigma；cAMP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自法國(guó)CIS生物公司；鈣流檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Molecular Devices公司；大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pcDNA3.1－N－myc和Gα載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；用于cAMP測(cè)試的單體化合物為中國(guó)海洋大學(xué)分離提純并提供［6］；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

PTC100 PCR儀購(gòu)自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；凝膠成像儀購(gòu)自基因公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Eppendorf公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo Life sciences公司；Analyst HTTM儀和FlexStation II Reader讀板儀購(gòu)于Molecular Devices公司.

1.3 方法

1.3.1 GPR41－pcDNA3.1質(zhì)粒的構(gòu)建

參照GenBank中提供的人GPR41的序列（序列號(hào)NM＿005304）設(shè)計(jì)并合成PCR擴(kuò)增引物，以人類基因組DNA為模板擴(kuò)增得到GPR41全長(zhǎng)序列.

引物序列如下：

上游引物：5′－GGGGTACCATGGATACAGGCCCCGAC－3′；

（斜體表示上游酶切位點(diǎn)KpnI）

下游引物：5′－CCGCTCGAGCTAGCTTTCAGCACAGGCA－3′

（斜體表示下游酶切位點(diǎn)XhoI）

運(yùn)用酶切連接等基因工程手段將GPR41序列插入pcDNA3.1－N－myc載體，構(gòu)建GPR41－pcDNA3.1重組質(zhì)粒.經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定確認(rèn)重組子的序列.

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

野生型中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）購(gòu)自中科院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù).該細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基培養(yǎng).待實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn).

1.3.3 GPR41穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

將GPR41－pcDNA3.1重組質(zhì)粒與pcDNA3.1空載體分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，操作方法按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000說(shuō)明書進(jìn)行.轉(zhuǎn)染48 h后，用含有750μg／mL G418抗生素的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選.將Gα質(zhì)粒與GPR41－pcDNA3.1或pcDNA3.1空載體共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，操作方法如上所述.轉(zhuǎn)染48 h后，用含有750μg／mL G418和5μg／mLBlasticidin的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選.以野生型CHO細(xì)胞作為篩選的陰性對(duì)照.待野生型CHO細(xì)胞全部死亡后，將具有抗生素抗性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，進(jìn)行單克隆篩選.經(jīng)篩選的單克隆細(xì)胞株（GPR41－CHO）或（GPR41－Gα－CHO）用于后續(xù)檢測(cè)鑒定.

1.3.4 用RT－PCR方法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆GPR41的表達(dá)

提取GPR41－CHO總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)為cDNA后，用PCR方法檢測(cè)GPR41的表達(dá).設(shè)計(jì)并合成檢測(cè)GPR41基因的引物，以GAPDH基因作為內(nèi)參.

GPR41引物序列 上游引物：5′－ttcttcaccaccatctatctcacc－3′；

下游引物：5′－aattctatgacgtagaccacgctg－3′.

GAPDH 引物序列 上游引物：5′－catcatccctgcatccactg－3′；

下游引物：5′－tgcctgcttcaccaccttct－3′.

1.3.5 Western Blot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆GPR41的表達(dá)

根據(jù)RT－PCR的結(jié)果挑選穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆，用Western及IP細(xì)胞裂解液、1 mmol／L PMSF和10μL／mL的Cocktail蛋白酶抑制劑提取細(xì)胞總蛋白.經(jīng)BCA法測(cè)定總蛋白濃度后，用于Western Blot檢測(cè).經(jīng)SDS－PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，用麗春紅染色.經(jīng)雙蒸水或TBST充分漂洗后，在5%BSA中室溫封閉1 h.按1∶1 000的比例稀釋一抗，4℃孵育過(guò)夜.經(jīng)漂洗后孵堿性磷酸酶連接的二抗，充分漂洗后用BCIP／NBT顯影.

1.3.6 cAMP法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆GPR41的活性

根據(jù)RT－PCR和Western Blot的結(jié)果篩選部分GPR41－CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆，以每孔103個(gè)細(xì)胞的密度鋪384孔板（孔底和孔壁均為黑色）培養(yǎng)24 h.因?yàn)镚PR41屬于Gi偶聯(lián)的受體，受體激活后會(huì)導(dǎo)致cAMP水平降低，故需要先用10μmol／L Foskolin孵育細(xì)胞30 min后，再進(jìn)行cAMP檢測(cè).按照法國(guó)CIS－Bio公司cAMP檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書操作，細(xì)胞內(nèi)源cAMP與XL665標(biāo)記的cAMP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合cAMP抗體，根據(jù)665 nm／620 nm的熒光值計(jì)算并分析細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的變化情況.

1.3.7 鈣流檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆GPR41的活性

篩選部分GPR41－Gα－CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆，以每孔3×104個(gè)細(xì)胞的密度鋪96孔板（透明底黑色壁），37℃培養(yǎng)24 h.按照Molecular Devices公司鈣流檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書配制Loading Buffer，并加入終濃度1.25 mmol／L Probenecid和2.5μmol／L的Fluo－3 AM 熒光染料.混勻后，按照每孔100μL加入細(xì)胞孔內(nèi).37℃孵育1 h后，利用FlexStation II Reader讀板儀收集細(xì)胞孔內(nèi)的熒光信號(hào).

1.3.8 GPR41穩(wěn)定細(xì)胞株受體激動(dòng)劑的篩選

用cAMP方法從海洋真菌次生代謝產(chǎn)物中篩選GPR41受體激動(dòng)劑，cAMP檢測(cè)方法如前所述，用于測(cè)試的單體化合物的濃度為10μmol／L，1μmol／L和100 nmol／L，每個(gè)濃度做3個(gè)平行孔.

1.3.9 數(shù)據(jù)處理及分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)及作圖均用Sigma－Plot 9.0軟件處理，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次.結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 GPR41－pcDNA3.1質(zhì)粒的構(gòu)建

從人基因組中用PCR擴(kuò)增人GPR41基因全長(zhǎng)片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，符合預(yù)期片段大?。? 041 bp）.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1a.GPR41－pc3.1重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后電泳結(jié)果見(jiàn)圖1b，酶切片段大小符合預(yù)期.將重組質(zhì)粒測(cè)序后，測(cè)序結(jié)果與Gen－Bank檢索的GPR41基因序列（序列號(hào)NM＿005304）完全一致.

圖1 GPR41－pcDNA3.1質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of GPR41－pcDNA3.1 plasmid

2.2 RT－PCR法檢測(cè)GPR41的表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，從RNA水平檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株中GPR41的表達(dá).圖2的RT－PCR結(jié)果表明在空載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中，無(wú)GPR41的擴(kuò)增條帶；而GPR41－CHO細(xì)胞中有明亮的擴(kuò)增條帶，說(shuō)明在RNA水平上檢測(cè)到GPR41的表達(dá).

圖2 RT－PCR檢測(cè)RNA水平GPR41的表達(dá)結(jié)果Fig.2 RT－PCR results to detect the RNA expression of GPR41

2.3 Western Blot檢測(cè)c－Myc標(biāo)簽的表達(dá)

選取部分定量結(jié)果較好的細(xì)胞克隆，用 Western Blot檢驗(yàn)GPR41質(zhì)粒所帶的c－Myc標(biāo)簽的表達(dá)，間接反應(yīng)GPR41的蛋白的表達(dá)水平.目的蛋白的大小應(yīng)為GPR41與c－myc融合蛋白的大小.圖3的Western Blot結(jié)果表明在野生型CHO細(xì)胞中，無(wú)目的條帶的表達(dá)；而GPR41－CHO不同的單克隆細(xì)胞株中有藍(lán)紫色的顯色條帶，說(shuō)明在蛋白水平上檢測(cè)到GPR41的表達(dá).

圖3 Western Blot方法檢測(cè)蛋白水平c－myc的表達(dá)結(jié)果Fig.3 Determination of GPR41 protein levels in CHO WT and transfected cells using western blot

2.4 GPR41穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中GPR41功能的檢測(cè)

根據(jù)Western Blot結(jié)果，選取部分GPR41－CHO克隆用cAMP方法檢測(cè)GPR41受體的功能.前人研究已經(jīng)證實(shí)GPR41屬于Gi／o偶聯(lián)受體［7］，因此需要先用腺苷酸環(huán)化酶的激活劑forskolin誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，當(dāng)GPR41受體與其配體結(jié)合后，引起cAMP濃度降低，以此來(lái)測(cè)定GPR41的活化情況.如圖4cAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10μmol／L forskolin在GPR41過(guò)表達(dá)細(xì)胞和Mock細(xì)胞中引起cAMP水平上升3倍左右.500μmol／L丁酸鈉引起G41過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株cAMP水平降低且有顯著差異（P＜0.05），而在mock細(xì)胞中cAMP水平未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05）.選取部分GPR41－Gα－CHO克隆用于檢測(cè)鈣流.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.500μmol／L丁酸鈉作用于對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有引起鈣流的變化，而作用于GPR41－Gα－CHO細(xì)胞株時(shí)引起了鈣流的變化.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GPR41穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功可以用于篩選GPR41受體的激動(dòng)劑.

圖4 500μmol／L丁酸鈉和10μmol／L forskolin分別作用于G41－CHO和Mock細(xì)胞引起的cAMP水平變化Fig.4 Effect of butyrate（500μmol／L）and forskolin（10μmol／L）on the release of cAMP in GPR41－CHO and the mock cells

圖5 500μmol／L丁酸鈉作用于GPR41－Gα－CHO和Mock細(xì)胞引起鈣流變化Fig.5 Effect of butyrate（500μmol／L）on the release of calcium in GPR41－Gα－CHO and the mock cells

2.5 GPR41穩(wěn)定細(xì)胞株受體激動(dòng)劑的篩選結(jié)果

每種單體化合物在初篩過(guò)程中選取3個(gè)作用濃度10μmol／L，1μmol／L和100 nmol／L，根據(jù)初篩結(jié)果，選取有響應(yīng)的化合物進(jìn)行復(fù)篩，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，以確保篩選結(jié)果的準(zhǔn)確.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，10μmol／L foskolin可以顯著提高GPR41－CHO和mock細(xì)胞中cAMP的水平，37號(hào)化合物可以顯著降低GPR41－CHO細(xì)胞的cAMP水平（P＜0.01），而mock細(xì)胞中cAMP水平則沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，37號(hào)化合物可能是GPR41受體的潛在激動(dòng)劑，在1μmol／L的濃度下即可引起細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的降低.其余化合物未見(jiàn)類似作用.

圖6 （a）37號(hào)化合物作用于G41－CHO初篩結(jié)果；（b）37號(hào)化合物作用于G41－CHO和 Mock細(xì)胞引起cAMP水平變化Fig.6 （a）Primary screen results of No.37 compound on cAMP accumulation in GPR41－CHO cells；（b）Effect of No.37 compound on cAMP accumulation in GPR41－CHO and Mock cells

3 討 論

G蛋白偶聯(lián)受體GPR41在多種組織中均有表達(dá)，而且在人、小鼠及大鼠等物種間的氨基酸序列高度保守.自從2003年發(fā)現(xiàn)GPR41的配體是短鏈脂肪酸后，已有研究表明GPR41與能量代謝密切相關(guān).但是目前關(guān)于GPR41受體的功能和GPR41受體激動(dòng)劑的研究仍需深化，因此本實(shí)驗(yàn)將研究目的確定為GPR41受體激動(dòng)劑的篩選，為后續(xù)研究該受體的功能，以及揭示GPR41在生理和病理?xiàng)l件下扮演的角色打下基礎(chǔ).

本文首先選擇中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）作為細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)镃HO細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞容易操作、背景干凈、內(nèi)源性干擾小等特點(diǎn)［2］.在構(gòu)建GPR41－CHO穩(wěn)定細(xì)胞株后，首先運(yùn)用RT－PCR和Western Blot檢測(cè)了RNA水平和蛋白水平上GPR41的表達(dá)，但是上述檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果并不足以說(shuō)明構(gòu)建的GPR41具有活性.隨后利用cAMP和鈣流檢測(cè)，從功能水平上進(jìn)行了驗(yàn)證.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)配體丁酸鈉與GPR41受體相結(jié)合時(shí)，可以通過(guò)cAMP水平的高低來(lái)評(píng)估受體激動(dòng)劑的活性.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的GPR41具有受體活性，過(guò)表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功.短鏈脂肪酸作為GPR41低親和力的配體，短鏈脂肪酸激活GPR41的濃度范圍在微摩爾數(shù)量級(jí)（幾百微摩爾至毫摩爾）［8］.短鏈脂肪酸相對(duì)的“低效”可能與它在血液中濃度較高以及其生理功能相關(guān).GPR41作為短鏈脂肪酸的低親和力受體，只在短鏈脂肪酸水平異常升高的情況下才會(huì)被激活，因此可以避免受體的持續(xù)活化［9］.除此之外，短鏈脂肪酸也并非GPR41特異性的配體，不同碳鏈長(zhǎng)度的短鏈脂肪酸，對(duì)于GPR41激活有不同的效力.因此篩選特異性高、親和力強(qiáng)的配體成為本課題的研究目標(biāo).篩選的范圍鎖定在從福建平海灣海藻來(lái)源的黃曲霉中提取的一系列次級(jí)代謝產(chǎn)物［10］，因?yàn)楹Ｑ笳婢紊x產(chǎn)物種類繁多，生物活性物質(zhì)豐富.近年來(lái)已經(jīng)從海洋真菌次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多種抗腫瘤藥物、生物毒素和酶抑制劑等生物活性物質(zhì)，研究海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物逐漸成為開發(fā)天然藥物資源的重要內(nèi)容.

cAMP篩選結(jié)果表明，在GPR41細(xì)胞中，1μmol／L37號(hào)化合物能夠降低由foskolin引起的cAMP水平升高，在mock細(xì)胞中則不會(huì)引起這種變化趨勢(shì).在另外一種GPCR－CHO過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（GPR12－CHO）未發(fā)現(xiàn)cAMP水平的變化.這一現(xiàn)象表明37號(hào)化合物具有GPR41受體激動(dòng)活性，有可能成為GPR41的潛在配體.經(jīng)結(jié)構(gòu)解析后發(fā)現(xiàn)，37號(hào)化合物是一種新化合物，屬于吡喃酮類化合物［11］.這是首次報(bào)道2－吡喃酮類化合物具有GPR41受體激動(dòng)活性.但是這種化合物是否是該受體特異的激動(dòng)劑，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明.

綜上所述，GPCR作為新藥靶點(diǎn)的意義備受關(guān)注，但是仍有一些重要問(wèn)題亟待解決，例如對(duì)GPR41生理功能的認(rèn)識(shí)和病理意義的研究，又如對(duì)初篩得到的化合物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究.利用cAMP檢測(cè)方法對(duì)海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物活性成分進(jìn)行研究，并對(duì)初篩得到的化合物進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)的修飾和優(yōu)化，并研究化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系，開發(fā)出有針對(duì)性和高效性的化合物，將對(duì)新藥的開發(fā)和對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體的功能研究將產(chǎn)生重要的影響.針對(duì)GPCR開發(fā)更多特異性強(qiáng)、副作用小的全新天然小分子化合物，將為藥物開發(fā)帶來(lái)新的突破.

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