REGγ，p53，NOTCH1 和BRAF 在甲狀腺癌中的表達及其臨床意義

亓 龍， 左 娣， 王 輝， 李曉濤

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，上海 200092；2.華東師范大學(xué) 生命醫(yī)學(xué)研究所，上海 200241）

0 引 言

REGgamma（即REGγ，或PSME3，或11Sγ，或PA28γ）是蛋白酶體調(diào)節(jié)因子，有研究表明REGγ在未分化甲狀腺癌中高表達［1］，而p53，BRAF的突變并高表達和甲狀腺癌遠處轉(zhuǎn)移是預(yù)后不佳的主要表現(xiàn)［2，3］.NOTCH1是NOTCH 信號通路中NOTCH 家族的4個主要蛋白之一，其與腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系［4］.近年來在分化型乳頭狀甲狀腺癌（PTC）中檢測出BRAF 基因突變，且逐漸成為研究熱點［5］.目前REGγ，p53，NOTCH1和BRAF之間的相關(guān)性報道尚未發(fā)現(xiàn).本文通過對2009年1月至2011年7月間的40例乳頭狀甲狀腺癌患者的臨床資料和術(shù)后病理，結(jié)合REGγ，p53，NOTCH1和BRAF表達的研究，分析它們之間的相關(guān)性及其臨床意義.

1 材料和方法

1.1 一般資料 乳頭狀甲狀腺癌及乳頭狀甲狀腺癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者40例，患者均采用甲狀腺葉全切除＋峽部切除＋部分淋巴結(jié)切除術(shù)并經(jīng)病理明確診斷，無其他原發(fā)性惡性腫瘤，術(shù)前未經(jīng)放療及化學(xué)藥物治療，且知情同意.

1.2 主要試劑 18S，REGγ，p53，NOTCH1和BRAF引物均由invitrogen公司合成，兔抗人REGγ多克隆抗體（Invitrogen公司）、鼠抗人p53、BRAF單克隆抗體及山羊抗人NOTCH1單克隆抗體和鼠抗兔、兔抗鼠及兔抗山羊二抗（Santa Cruz公司），妙通免疫組化試劑盒（上海妙通生物公司）均由華東師范大學(xué)生命醫(yī)學(xué)研究所李曉濤教授實驗室惠贈.

1.3 Realtime－PCR 總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄Realtime－PCR分別對甲狀腺癌組織按照Trizol（TaKaRa公司）說明書提取組織總RNA.分別取3μg總RNA用RevertAidTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司）進行逆轉(zhuǎn)錄.用Sybgreen試劑盒（Toyobo公司）和Realtime—PCR儀（Agilent Technologies公司）進行擴增.引物序列如表1所示.擴增程序：95℃，5min；95℃，5s；58 ℃，30s；72 ℃，25s，共40循環(huán).均進行溶解曲線分析.采用相對定量法進行數(shù)據(jù)處理：

表1 引物序列

1.4 組織切片及免疫組織化學(xué)檢測 標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋切片；免疫組織化學(xué)采用鏈霉素抗生物素蛋白—過氧化物酶連結(jié)法即SP法，一抗分別為REGγ（稀釋度為1∶300），p53（稀釋度為1∶100），NOTCH1（稀釋度為1∶300）和BRAF（稀釋度為1∶400）單克隆抗體，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片.每批染色均設(shè)陽性及陰性對照片，以排除假陽性及假陰性.

1.5 結(jié)果判斷 陽性表達結(jié)果呈棕黃色或棕褐色.一般按陽性細胞數(shù)［無（－），偶見、通常＜5%（＋／－），5%～25%（＋），26%～50%（＋＋），＞50%（＋＋＋）］和染色深淺［淺（＋），中（＋＋），深（＋＋＋）］進行綜合評分［6］.NOTCH1，p53，BRAF和REGγ陽性細胞多數(shù)為核著色，呈棕黃色顆粒，少數(shù)為較弱的細胞質(zhì)染色.

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0for window統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，采用χ2檢驗及Spearman相關(guān)性分析.P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 Realtime－PCR檢測REGγ，p53，NOTCH1 及BRAF mRNA表達

通過Realtime－PCR檢測6例乳頭狀甲狀腺癌組織發(fā)現(xiàn)，與正常甲狀腺組織相比，甲狀腺癌組織中REGγmRNA水平呈上升趨勢，BRAFmRNA水平呈下降趨勢，NOTCH1及p53 mRNA水平變化無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖1）.

圖1. NOTCH1，p53，BRAF，REGγmRNA在甲狀腺癌中的表達Fig.1 The relative mRNA level of NOTCH1，p53，REGγand BRAFin thyroid cancer

2.2 REGγ、p53、NOTCH1和BRAF在甲狀腺癌中的表達

40例乳頭狀甲狀腺癌組織中，有35例REGγ染色呈陽性，陽性率為87.5%；同時檢測出p53，BRAF 和NOTCH1 陽性表達率分別為47.5%（19／40）、25.0%（10／40）、20.0%（8／40），（見圖2）.由此可見，REGγ蛋白在甲狀腺癌組織中陽性表達率最高，BRAF 和NOTCH1陽性表達率相對較低（見表2）.

表2 REGγ，p53，NOTCH1和BRAF在甲狀腺癌組織中的表達Tab.2 Expressions of REGγ，p53，NOTCH1 and BRAFin thyroid cancer

2.3 REGγ、p53、BRAF和NOTCH1的表達與甲狀腺癌臨床病例因素的關(guān)系

REGγ表達與甲狀腺癌患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的45歲以上患者REGγ陽性越明顯（P＝0.0151＜0.05，見圖3）；而與患者性別無顯著相關(guān)性（P＝0.742＞0.05）；p53，BRAF和NOTCH1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況呈正相關(guān)（P＝0.0253＜0.05）.（見表3）

圖2 REGγ，p53，NOTCH1和BRAF在甲狀腺癌中的表達Fig.2 The expression of REGγ，p53，NOTCH1 and BRAFin thyroid cancer

表3 REGγ，p53，BRAF和NOTCH1陽性表達與甲狀腺癌臨床病理因素的關(guān)系Tab.3 Relationship between prevalence of REGγ，p53，BRAF and NOTCH1 and various clinicopathological features（n，%）

2.4 REGγ與NOTCH1，p53，BRAF的關(guān)系

REGγ陽性表達與NOTCH1，p53，BRAF 表達呈正相關(guān)（P＜0.05）（見表4）.經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，p53陽性表達患者，NOTCH1（r＝0.021 1，＜0.05）和BRAF（r＝0.023 3，＜0.05）均高表達；NOTCH1陽性表達與BRAF（r＝0.243，＞0.01）無顯著性相關(guān)（見表4）.

圖3 REGγ的表達與臨床病理因素的相關(guān)性Fig.3 The relevance of clinical pathological factors and expression of REGγ

表4 REGγ陽性表達與NOTCH1，p53，BRAF的關(guān)系Tab.4 Relationship between the expressions of REGγand NOTCH1，p53，BRAF

3 討 論

REGγ，亦稱PA28γ，11Sγ或PSME3，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者血清中首次被發(fā)現(xiàn)，是一種自身免疫性抗體的核內(nèi)靶蛋白［7，8］.REGγ屬于11S蛋白酶激活因子家族或REG家族.REGγ在大腸癌［9］和甲狀腺癌［10］中存在差異表達，并在癌癥發(fā)展過程中發(fā)揮作用［9－11］.REGγ表達的高低對評價細胞的增殖狀態(tài)、研究腫瘤的生物學(xué)行為、判斷其預(yù)后具有重要科研和臨床意義.

本研究顯示REGγ表達與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，隨著年齡增長，REGγ陽性率增高，且兩個年齡段REGγ陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其REGγ陽性率也增高，且REGγ陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）.這說明REGγ表達與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān).關(guān)于REGγ表達與乳頭狀甲狀腺癌遠處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究，國內(nèi)外尚鮮見報道，故此結(jié)果未能參照比較.

p53基因是重要的細胞凋亡調(diào)控基因，位于17號染色體，編碼一個由393個氨基酸組成的核磷蛋白，在許多組織中均有表達.p53存在野生型和突變型兩種亞型，免疫組織化學(xué)所檢測的主要為突變型，突變型p53基因可引起細胞的轉(zhuǎn)化和癌變，導(dǎo)致細胞無限增生.研究表明［12］，大約50%的人類腫瘤都有p53基因突變.最近有實驗表明，REGγ可以通過促進MDM2介導(dǎo)的p53蛋白泛素化途徑而使p53水平降低，但對突變型p53作用則相反［13］.本研究顯示在甲狀腺癌中p53蛋白的陽性率為47.5%，且與REGγ表達呈正相關(guān)，說明p53基因在部分甲狀腺癌中存在明顯突變，兩者在腫瘤的生長、侵襲過程中有協(xié)同和相互調(diào)節(jié)作用.

BRAF基因位于7號染色體，編碼B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴性激酶的激酶（B－Raf kinase，BRAF），它是RAS／RAF／MEK／ERK 信號通路（即 MAPK 通路）的關(guān)鍵成分，此信號通路能調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等［14］，當(dāng)其發(fā)生突變時，該通路將持續(xù)激活，使細胞異常增殖、分化最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［15］.本研究顯示在甲狀腺癌中BRAF蛋白的陽性率為25.0%（10／40），且與REGγ表達呈正相關(guān)，說明BRAF基因在部分甲狀腺癌中可能存在突變，兩者在腫瘤的生長、侵襲過程中可能存在協(xié)同和相互調(diào)節(jié)作用.

NOTCH是一種在進化上十分保守的跨膜受體蛋白家族.哺乳動物中有4個受體，分別為NOTCH1—NOTCH4.有研究顯示，NOTCH1高表達可引起人類乳腺癌的低分化和低生存率［16］，顯示出NOTCH 基因的原癌基因作用.但也有不同的報道，在瞬時轉(zhuǎn)染NOTCH的SMMC－ICD7721細胞中，NOTCH通過作用于細胞內(nèi)的多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制肝癌細胞的增殖和促進凋亡［17］，顯示出抑癌基因的所用.這些結(jié)果提示，同一種NOTCH受體在不同的組織類型中作用不同.本研究顯示在甲狀腺癌中NOTCH1蛋白的陽性率為20.0%（8／40），且與REGγ表達呈正相關(guān)，提示NOTCH 基因的表達在部分甲狀腺癌中存在異常，兩者在腫瘤的生長、侵襲過程中可能存在協(xié)同和相互調(diào)節(jié)作用.

綜上所述，甲狀腺癌組織中REGγ的表達與p53、BRAF和NOTCH1的表達呈正相關(guān)，其與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況呈正相關(guān)，推測REGγ可能是甲狀腺癌中p53、BRAF、NOTCH信號通路異常的共同關(guān)鍵因子，但具體機制尚在進一步研究中.同時REGγ最初是在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中被發(fā)現(xiàn)的，故有望應(yīng)用于甲狀腺癌患者的血清中，結(jié)合本研究的臨床價值，從而減少了不必要的醫(yī)療資源的浪費，也為個體化診斷與治療提供理論依據(jù).

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