甘氨酸對燒傷大鼠心肌細胞能量代謝的影響＊

李 騰，彭 靖，呂尚軍，吳 煒，張 勇，徐淑秀△，彭 曦▲

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院護理系，安徽蚌埠233030；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍燒傷研究所/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室，重慶400038）

甘氨酸對燒傷大鼠心肌細胞能量代謝的影響＊

李 騰1，彭 靖1，呂尚軍2，吳 煒2，張 勇2，徐淑秀1△，彭 曦2▲

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院護理系，安徽蚌埠233030；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍燒傷研究所/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室，重慶400038）

目的探討甘氨酸對燒傷后大鼠心肌細胞能量代謝的影響。方法將72只Wistar大鼠隨機分成正常對照組（C組）、燒傷對照組（B組）、甘氨酸組（Gly組）。B、Gly組建立30%體表面積Ⅲ度燒傷大鼠模型，觀察傷前及燒傷后12、24、48、72h大鼠心肌細胞能量代謝的變化，同時檢測傷后高能磷酸化合物（AMP、ADP和ATP）、血漿乳酸和谷胱甘肽（GSH）的水平。結(jié)果燒傷大鼠心肌能量代謝發(fā)生障礙，與C組相比，B組和Gly組大鼠心肌ATP及GSH水平大幅下降（P＜0.01），而AMP、ADP、血乳酸水平則大幅上升（P＜0.01）；Gly組大鼠心肌ATP、GSH下降以及AMP、ADP、血乳酸上升幅度均明顯低于B組（P＜0.01）。結(jié)論甘氨酸能改善燒傷后心肌有氧代謝，減少乳酸生成，有效降低燒傷后心肌受損程度，具有很好的心肌保護作用。

甘氨酸；心肌；燒傷；能量代謝；大鼠

在嚴重?zé)齻蛐募∪毖?、缺氧時，心臟作為全身血液循環(huán)的動力器官，心肌的損傷和功能減退必將進一步加重全身的缺血、缺氧，造成有氧代謝障礙，乳酸代謝產(chǎn)物堆集，產(chǎn)生大量活性自由基，從而導(dǎo)致細胞損傷，形成惡性循環(huán)。為此，針對心肌能量代謝障礙的治療是減輕燒傷后心肌損害的重要措施。近年來研究發(fā)現(xiàn)，游離的甘氨酸具有顯著的組織、細胞保護作用［1］。它通過激活突觸后膜上的甘氨酸受體來發(fā)揮作用，甘氨酸與其受體結(jié)合后，導(dǎo)致心肌細胞膜去極化明顯減輕，使細胞膜電壓依賴性鈣離子通道開放減少，鈣離子內(nèi)流減少，從而起到細胞保護作用［2－4］。但鮮見甘氨酸對燒傷后心肌能量代謝影響的報道。本研究擬觀察甘氨酸對燒傷大鼠心肌能量代謝的影響，以及為臨床合理使用甘氨酸奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物模型

1.1.1 燒傷模型的制作及分組 健康成年 Wistar大鼠72只，體質(zhì)量（210±20）g，雌雄不拘（由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供）。隨即分成3組，正常對照組（C組）、燒傷對照組（B組）、甘氨酸組（Gly組）。C組8只大鼠，其他各組每個時相點各8只大鼠。C組大鼠不予燒傷，其他2組大鼠燒傷前禁食12 h，1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，背部電推剃毛后8%硫化鈉脫毛，3%固體汽油燒傷15s。傷后立即腹腔注射50mL/kg的乳酸林格氏液抗休克。創(chuàng)面涂2%聚維酮碘抗感染，每天2次，傷后給予標準動物顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2 時相設(shè)置和給藥劑量 實驗分燒傷后12、24、48、72h 4個時相點。傷后Gly組腹腔注射給予甘氨酸（0.5g·kg－1·d－1），B組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2 檢測指標

1.2.1 心肌組織高能磷酸化合物的檢測 取左心室立即用在液氮中預(yù)冷的金屬夾板將心肌組織夾成冷凍薄片，迅速稱取100mg心肌組織，加入預(yù)冷的0.42mol/L高氯酸制成勻漿，再加入1mol/L氫氧化鉀中和，然后用超聲波細胞粉碎器將線粒體膜打碎，使能量物質(zhì)全部釋放于溶液中（以上操作過程均在冰水中進行）。然后3 000r/min離心15min，上清液用0.2 m微孔濾膜過濾，取10L濾液HPLC上柱分析AMP、ADP、ATP。蛋白濃度的測定方法及步驟同前。能荷（energy charge，EC）＝（ATP＋1/2ADP）÷ （ATP＋ADP＋AMP）。

1.2.2 心肌組織谷胱甘肽（GSH）的檢測 斷頸處死大鼠，立即剖胸取出心臟，剪取右心室心尖區(qū)部位組織，勻漿。按試劑盒說明書操作，比色法測定GSH水平。GSH水平（mg/g）＝（測定管吸光度值－空白管吸光度值）÷（標準管吸光度值－空白管吸光度值）×標準管濃度（0.5mmol/L）×GSH相對分子質(zhì)量÷組織蛋白水平（g/L）。其中組織蛋白水平測定參照BCA法。

1.2.3 全血乳酸變化的檢測 各組各時相點麻醉大鼠從插管導(dǎo)管中取血，每組取0.1mL置入抗凝管中并加入0.6mL蛋白沉淀劑，輕輕顛倒混勻，靜置10min后，3 500～4 000r/min離心8min，取上清液進行測定。按照說明書提供的操作方法，測定全血乳酸的水平。乳酸水平（mmol/L）＝（測定管吸光度值－空白管吸光度值）÷（標準管吸光度值－空白管吸光度值）×標準濃度×樣本稀釋倍數(shù)（標準濃度＝3mmol/L，樣本稀釋倍數(shù)＝7倍）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用多因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心肌組織高能磷酸化合物（AMP、ADP和ATP）水平的變化情況 B、Gly組心肌組織中的ATP和EC均開始下降，相同時相點明顯低于C組（P＜0.01）；AMP和ADP在燒傷后均上升，相同時相點明顯高于C組（P＜0.01）；Gly組各項指標于相同時相點較B組變化程度小，Gly組于12h作用明顯（P＜0.05），見表1～4。

2.2 3組大鼠心肌組織GSH水平的變化情況 燒傷后GSH迅速消耗，B組隨時相持續(xù)下降，72h達最低（P＜0.01）；Gly組GSH的下降程度明顯緩慢（P＜0.05），見表5。

2.3 3組大鼠心肌組織全血乳酸水平的變化情況 燒傷后全血乳酸迅速上升，24h達最高，隨即開始下降（P＜0.01）；Gly組隨時相持續(xù)上升，24h達最高，水平低于同時相B組（P＜0.05）。見表6。

表1 3組大鼠不同時相點燒傷后AMP水平的變化（μmol/g±s，n＝8）

表1 3組大鼠不同時相點燒傷后AMP水平的變化（μmol/g±s，n＝8）

－：表示無數(shù)據(jù)；a：P＜0.01，與C組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與B組同時相點比較。

0h 12h 24h 48h 72h B組 － 0.98±0.08a0.89±0.01a0.90±0.06a0.81±0.08組別a Gly組 － 1.11±0.05ac0.97±0.03ab0.99±0.08ac0.90±0.04acC組0.81±0.0

表2 3組大鼠不同時相點燒傷后ADP水平的變化（μmol/g±s，n＝8）

表2 3組大鼠不同時相點燒傷后ADP水平的變化（μmol/g±s，n＝8）

－：表示無數(shù)據(jù)；a：P＜0.01，與C組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與B組同時相點比較。

0h 12h 24h 48h 72h B組 － 0.66±0.64a0.55±0.49a組別0.48±0.29 0.47±0.27 Gly組 － 0.63±0.68ab0.61±0.59ab0.58±0.44ac0.53±0.38acC組0.43±0.2

表3 3組大鼠不同時相點燒傷后ATP水平的變化（μmol/g±s，n＝8）

表3 3組大鼠不同時相點燒傷后ATP水平的變化（μmol/g±s，n＝8）

－：表示無數(shù)據(jù)；a：P＜0.01，與C組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與B組同時相點比較。

0h 12h 24h 48h 72h B組 － 2.28±0.25a2.04±0.07a1.79±0.07a1.71±0.14組別a Gly組 － 2.46±0.29ab2.39±0.08ab2.11±0.10ac2.07±0.10acC組2.53

表4 3組大鼠不同時相點燒傷后EC水平的變化（±s，n＝8）

表4 3組大鼠不同時相點燒傷后EC水平的變化（±s，n＝8）

－：表示無數(shù)據(jù)；a：P＜0.01，與C組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與B組同時相點比較。

0h 12h 24h 48h 72h B組 － 0.52±0.04a0.43±0.02a0.18±0.01a0.33±0.04組別a Gly組 － 0.48±0.05ab0.50±0.02ac0.40±0.04ac0.42±0.02acC組0.55±0.04

表5 3組大鼠不同時相點燒傷后GSH水平的變化（μmol/g±s，n＝8）

表5 3組大鼠不同時相點燒傷后GSH水平的變化（μmol/g±s，n＝8）

－：表示無數(shù)據(jù)；a：P＜0.01，與C組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與B組同時相點比較。

0h 12h 24h 48h 72h B組 － 60.50±4.20a57.80±0.48a54.90±2.20a54.90±2.20組別a Gly組 － 66.80±7.95ab66.70±0.90ab58.90±1.23ac58.40±0.71abC組72.3

表6 3組大鼠不同時相點燒傷后全血乳酸水平的變化（μmol/g±s，n＝8）

表6 3組大鼠不同時相點燒傷后全血乳酸水平的變化（μmol/g±s，n＝8）

－：表示無數(shù)據(jù)；a：P＜0.01，與C組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與B組同時相點比較。

0h 12h 24h 48h 72h B組 － 5.73±0.26a6.22±0.32a5.81±0.29a5.31±0.43組別a Gly組 － 5.24±0.29ac5.71±0.18ab5.45±0.30ac5.28±0.36aC組4.4－

3 討 論

心肌缺血、缺氧性損傷常導(dǎo)致細胞能量代謝障礙，不僅可引起心肌細胞內(nèi)環(huán)境紊亂，還能引起心肌收縮能力下降［5－6］。燒傷早期存在心肌缺血、缺氧性損害，導(dǎo)致心功能不全，還可誘發(fā)或加重休克，以及全身其他組織器官的缺血、缺氧損害和炎癥反應(yīng)［7－8］。故改善燒傷早期心肌能量代謝障礙逐漸成為研究熱點。嚴重?zé)齻?，心肌血液灌流不足，使心肌細胞缺氧、缺乏能量底物和氧化磷酸化過程中所需的各種基質(zhì)，線粒體內(nèi)有氧氧化過程障礙，結(jié)果使ATP生成減少，導(dǎo)致心肌組織中高能磷酸化合物水平下降。實驗結(jié)果表明，燒傷后心肌組織ATP水平和EC均明顯低于傷前，并呈現(xiàn)進行性下降的趨勢，傷后72 h降至谷底。甘氨酸在體內(nèi)不是直接的能源物質(zhì)，在心肌細胞內(nèi)也不參與轉(zhuǎn)氨基作用，但可作為一碳單位的來源參與能量代謝過程。因此，燒傷后及時給予作為機體能量代謝重要底物的甘氨酸對改善心肌細胞能量代謝具有重要意義。

甘氨酸能改善心肌細胞能量合成方式。燒傷后心肌組織營養(yǎng)血供大幅降低，導(dǎo)致細胞處于乏氧狀態(tài)，此時細胞能量代謝以有氧代謝為主轉(zhuǎn)為以無氧酵解為主。無氧酵解時，能量底物利用率大幅下降。盡管無氧酵解在短時間內(nèi)提供一定量的ATP，但如果細胞長時間處于無氧酵解狀態(tài)，不僅無法滿足細胞的能量需求，還會由于代謝產(chǎn)物乳酸的堆積，造成細胞進一步損傷。實驗結(jié)果顯示，燒傷后血乳酸水平迅速上升，24h即達峰值，但明顯低于B組，說明燒傷后機體能量代謝中無氧酵解迅速增加，能量合成障礙。給予甘氨酸后乳酸峰值仍出現(xiàn)在24h，但明顯低于B組，同時ATP明顯增加，提示使用甘氨酸后能改善機體能量合成方式，降低對無氧酵解的依賴，糾正乳酸堆積，增加能量合成。

燒傷后由于心肌血流灌注不足導(dǎo)致心肌缺血、缺氧，再灌注時心肌組織產(chǎn)生大量的活性自由基可以直接攻擊線粒體蛋白巰基，影響線粒體氧化代謝的3個關(guān)鍵酶及電子傳遞鏈中酶的活性，導(dǎo)致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）減少，ATP合成障礙［9］。GSH是機體重要的自由基清除劑，它是由g－羧基與半胱氨酸及甘氨酸在體內(nèi)合成的三肽，甘氨酸是其組成成分之一。實驗結(jié)果顯示，燒傷后心肌組織中GSH水平迅速下降，說明燒傷后GSH合成減少或生成的大量自由基導(dǎo)致GSH耗竭。給予甘氨酸，心肌組織GSH下降程度明顯低于B組。在燒傷后12、24h與傷前差異無統(tǒng)計學(xué)意義。GSH對自由基的清除減輕了線粒體脂質(zhì)過氧化損害，維護了細胞正常的代謝功能［10］。

綜上所述，甘氨酸能夠作為一碳單位的來源參與能量代謝過程，改善能量合成方式，促進抗氧化物質(zhì)GSH的合成，減少自由基的產(chǎn)生，糾正乳酸堆積，減輕細胞損傷。其還能維護心肌細胞線粒體膜穩(wěn)定性，減輕多種致傷因素導(dǎo)致的心肌損害［11］，但甘氨酸改善燒傷后心肌細胞能量代謝的作用機制還需進一步探討。

［1］周軍利，黃躍生，黨永明，等.甘氨酸對缺血缺氧心肌細胞能量代謝的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2008，8（6）：1093－1095.

［2］陳楚天，陸大祥，戚仁斌，等.損害性因素對乳鼠心肌細胞甘氨酸受體α1亞基表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2008，24（5）：843－848.

［3］Qi RB，Zhang JY，Lu DX，et al.Glycine receptors contribute to cytoprotection of glycine in myocardial cells［J］.Chin Med J（Engl），2007，120（10）：915－921.

［4］Kuzumoto M，Takeuehi A，NakaiH，et al.Simulation analysis of Intracellular Na＋and Cl＋homeostasis during betal adrenergic stimulation of cardiac myocyte［J］.Prog Biophys Mol Biol，2008，96（l/2/3）：171－186.

［5］Miller RR Jr，Hay CM，Striegnitz TR，et al.Exogenous glycine partially attenuates homocysteine induced apoptosis and membrane peroxidation in chick embryos［J］.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2006，144（1）：25－33.

［6］盛凈，陸平.心肌能量代謝治療與老年缺血性心臟病［J］.老年醫(yī)學(xué)與保健，2012，18（1）：8－12.

［7］黃躍生.燒傷后早期心肌損害與防治［J］.中華燒傷雜志，2008，24（5）：369－371.

［8］Kodde IF，van der Stok J，Smolenski RT，et al.Metabolic and genetic regulation of cardiac energy substrate preference［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2007，146（1）：26－39.

［9］Lee HL，Chen CL，Yeh ST，et al.Biphasic modulation of the mitochondrial electron transport chain in myocardial ischemia and reperfusion［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，302（7）：1410－1422.

［10］Li S，Zheng MQ，Rozanski GJ.Glutathione homeostasis in ventricular myocytes from rat hearts with chronic myocardial infarction［J］.Exp Physiol，2009，94（7）：815－824.

［11］陳夢飛，陸大祥，戚仁斌，等.甘氨酸脂質(zhì)體對心肌細胞線粒體膜電位及凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2008，24（7）：1254－1258.

Effects of glycine on energy metabolism of myocardium after burn injury＊

LiTeng1，PengJing1，LvShangjun2，WuWei2，ZhangYong2，XuShuxiu1△，PengXi2▲
（DepartmentofNursing，BengbuMedicalCollege，Bengbu，Anhui233030，China；2.InstituteofBurnResearch，SouthwesternHospital，StatekeyLaboratoryofTrauma，BurnsandCombinedInjury，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China）

ObjectiveTo discuss the effects of glycine on energy metabolism of myocardium after burn injury.MethodsThe rat model of 30%body surface area third degree burn was adopted.72Wistar rats were randomly divided into three groups：normal control（C），burn control（B）and glycine treatment（Gly）groups.Resting energy metabolism of myocardium，the level of high－energy phosphate compound（AMP，ADP，ATP），lactic acid and glutathione（GSH）were determined before burn and on post－burn 12，24，48，72hours.ResultsAfter burn injury，energy metabolism of myocardium had notable disorder.Compared with group C，the levels of ATP and GSH in group B and Gly were obviously decreased（P＜0.01），while the levels of AMP，ADP and lactic acid were significantly increased（P＜0.01）.Both the declining range of ATP，GSH and the rising range of AMP，ADP and lactic acid in group Gly were remarkably lower than those in group B（P＜0.01）.ConclusionGlycine administration could improve aerobic metabolism of myocardium after burn injury，reduce the count of lactic acid，abate the degree of cardiac injury after burn injury，and possess protection of myocardium.

glycine；myocardium；burns；energy metabolism；rats

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.33.005

A

1671－8348（2012）33－3476－03

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃資助項目（973計劃，2005CB522601）；第三軍醫(yī)大學(xué)臨床創(chuàng)新基金（2009XLC10）?！?通訊作者，Tel：13955233526；E－mail：xxssxx53＠sina.com。▲ 通訊作者，Tel：13983402384；E－mail：pxlrmm＠163.com。

2012－02－16

2012－07－22）