新疆哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中酵母菌的分離鑒定

李 靜，賈佳佳，楊 艷，田 燕，武 運(yùn)*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

新疆哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中酵母菌的分離鑒定

李 靜，賈佳佳，楊 艷，田 燕，武 運(yùn)*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

從新疆南山、水西溝、伊犁昭蘇采集的哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中共分離得到酵母菌34株。采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性方法對(duì)酵母菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為Schizosaccharomyces 1株、Sehizoblastosporion 1株、Torulopsis 1株、Saccharomycodes 1株、Kloechera 9株、Kluveromyces 5株、Dekker 8株、Trichosporon 3株、Hansenula 2株、Brettanomyces 3株。利用5.8S rDNA序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)菌株12號(hào)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，鑒定結(jié)果為：菌株12與標(biāo)準(zhǔn)菌株HQ396523.1同源性達(dá)到96%，為Kluveromyces的Kluveromyces marxianus，與傳統(tǒng)鑒定結(jié)果一致，表明5.8S rDNA序列分析在酵母菌鑒定上的準(zhǔn)確性。

酸馬奶；酵母菌；分離鑒定；分子生物學(xué)

酸馬奶(koumiss)是以新鮮馬奶為原料，加入乳酸菌和酵母菌等微生物的天然發(fā)酵劑，自然發(fā)酵形成的一種酸性低乙醇含量的乳飲品[1-3]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)飲食結(jié)構(gòu)的要求越來(lái)越嚴(yán)格[4]，不僅要考慮營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的全面性，而且要注意被機(jī)體實(shí)際吸收利用的多少。發(fā)酵奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和吸收利用率均比鮮奶還高，因此酸馬奶酒更引起了人們的重視[5]。由于酸馬奶酒有著特殊的有益微生物群，將來(lái)必定成為一種很理想的微生態(tài)制劑發(fā)揮它應(yīng)有的作用，而且有可能從酸馬奶酒的微生物群中篩選出對(duì)結(jié)核分枝桿菌等細(xì)菌具有高度抗菌活性的微生物來(lái)，生產(chǎn)新型抗生素[6-8]。酵母菌體本身也有很高的利用價(jià)值，并應(yīng)用于食品工業(yè)、飼料工業(yè)及生化制藥中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)新疆哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中酵母菌進(jìn)行分離純化鑒定，為新疆哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中酵母菌菌種資源的保藏與開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

酸馬奶采集于新疆南山哈薩克族牧民家自制酸馬奶、水西溝哈薩克族牧民家自制酸馬奶、伊犁昭蘇哈薩克族牧民家自制酸馬奶。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離純化用培養(yǎng)基：麥芽糖培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基；鑒定用培養(yǎng)基：糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基、碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氮源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無(wú)維生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基、產(chǎn)類(lèi)淀粉培養(yǎng)基、產(chǎn)酸培養(yǎng)基、分解尿素培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑

酵母菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、ZM404 DL2000 DNA Marker、dNTP Mixture (均為 2.5mmol/L)、EB染色液(10mg/L) 北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

50×TAE電泳緩沖液貯液：Tris 242g，濃度為17.4mol/L、冰乙酸57.1mL，濃度為0.5mol/L EDTA (pH8.0)200mL，定容至1000mL。0.8%的瓊脂糖凝膠：0.8g瓊脂糖溶于100mL 0.5×TAE緩沖液中；2%的瓊脂糖凝膠：2g瓊脂糖溶于100mL 0.5×TAE緩沖液中。

1.2 儀器與設(shè)備

LD2X-30KA 立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；HR40-ⅡA2 生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、HWS26 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；XSP-2CA 生物顯微鏡 廈門(mén)Motic實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；LSM 510 SYSTEM 激光共聚焦顯微鏡 北京普瑞賽司儀器有限公司；AR2130/C型精密電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；THE-82 氣浴恒溫振蕩器 常州市國(guó)立試驗(yàn)設(shè)備研究所；050-810 Tgradient 48型PCR擴(kuò)增儀 德國(guó)Biometra公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠(chǎng)；JY04S型凝膠成像儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；US-Patent Research型移液槍、MiniSpin型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離與純化

吸取1mL酸馬奶置于裝有9mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，充分振蕩使其混勻。將混合后酸馬奶進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)♂尪葹?10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，選取10-2、10-3、10-4、10-5、10-65個(gè)稀釋度，用移液器吸取1mL樣液，采用涂布法，將樣液均勻涂布于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，將制備好平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，觀(guān)察并記錄菌落特征，挑取菌落較大，且呈白色或乳白色、粉色單個(gè)菌落進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，呈圓形或橢圓形、臘腸狀且細(xì)胞較大者，將其接種于麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，重復(fù)幾次純化酵母菌，直至鏡檢結(jié)果為同一細(xì)胞形態(tài)后，將其接種于YPD固體培養(yǎng)基斜面上，恒溫培養(yǎng)48h后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酵母菌的生理生化特性鑒定

酵母菌分離菌株主要通過(guò)繁殖方式觀(guān)察、子囊孢子形成實(shí)驗(yàn)、擲孢子形成實(shí)驗(yàn)、菌絲形成實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、脲酶分解實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酯實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)、無(wú)維生素生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)等生理生化特征進(jìn)行鑒定[9-10]。

1.3.3 酵母菌的5.8S rDNA分析

1.3.3.1 酵母菌基因組DNA的提取

取1mL活化菌懸液，12000r/min離心1min，棄上清液，收集菌體；DNA的提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上的方法進(jìn)行操作；然后將所提取的DNA于－20℃保存。

1.3.3.2 5.8S rDNA PCR擴(kuò)增

將上述制備的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，采用50μL反應(yīng)體系，用一對(duì)與ITS序列互補(bǔ)的引物，ITS 1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和ITS 4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3＇)對(duì)5.8S-ITS區(qū)域酵母菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：1μL酵母菌DNA，引物ITS 1和ITS 4各1μL，ddH2O 37μL，5μL的10×Buffer(含Mg2+)，4μL 的dNTP(超純)，0.25μL 的Taq DNA聚合酶(5U/μL)，0.75μL的雙蒸水。PCR擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45min，從變性到延伸30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；保溫4min。4℃暫時(shí)保存，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓100V，電泳液為1×TAE。電泳后，用EB染色20min，紫外燈下觀(guān)察，拍照。

1.3.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序和序列分析

5.8S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物使用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒，按說(shuō)明回收、純化目的片段。經(jīng)純度檢測(cè)后，委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中一致序列進(jìn)行比對(duì)及相似性分析。

1.3.3.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用軟件DNA Star和MEGA 4.1，將測(cè)得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)種屬代表菌株的5.8S rDNA 基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)特征

圖1 酵母菌的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of yeast

從新疆哈薩克族傳統(tǒng)自制酸馬奶中共分離出34株酵母菌，菌落形態(tài)呈圓形或橢圓形，表面光滑濕潤(rùn)或粗糙，顏色呈乳白色或乳黃色，表面凸起，邊緣整齊或不規(guī)則，無(wú)性繁殖為芽殖或裂殖，細(xì)胞形態(tài)為圓、橢圓、卵圓等。

酵母菌在經(jīng)YPD 培養(yǎng)基活化后，將制得的菌株在激光共聚焦顯微鏡及普通光學(xué)顯微鏡下，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖1，細(xì)胞形態(tài)符合酵母菌特征。

2.2 酵母菌分離株生理生化特性鑒定結(jié)果

采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性方法對(duì)酵母菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為： Schizosaccharomyces 1株、Sehizoblastosporion 1株、Torulopsis 1株、Saccharomycodes 1株、Kloechera 9株、Kluveromyces 5株、Dekker 8株、Trichosporon 3株、Hansenula 2株、Brettanomyces 3株。根據(jù)《食品微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[9]和《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[10]的方法，酵母菌種屬的鑒定結(jié)果見(jiàn)表1～4。

表1 酵母菌菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)特征鑒定結(jié)果Table 1 Description of colonial and cell morphology of isolated yeasts

表2 酵母菌生理生化特性鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical properties of isolated yeasts

表3 酵母菌糖發(fā)酵鑒定結(jié)果Table 3 Results of carbohydrate fermentation tests for identification of isolated yeasts

續(xù)表3

表4 酵母菌碳源、氮源同化鑒定結(jié)果Table 4 Results of carbon and nitrogen assimilation tests for identification of isolated yeasts

2.3 5.8S rDNA 分析

2.3.1 部分優(yōu)勢(shì)酵母菌菌株5.8S rDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

對(duì)優(yōu)勢(shì)酵母菌菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，通過(guò)PCR擴(kuò)增該菌株的5.8S rDNA序列，用2%瓊脂糖凝膠對(duì)菌株的5.8S rDNA和ITS擴(kuò)增產(chǎn)物做電泳檢測(cè)，溴化乙錠染色成像后，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍攝，在750bp左右出現(xiàn)條帶，可初步鑒定為酵母菌，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酵母菌菌株的5.8S rDNA PCR擴(kuò)增后的電泳檢測(cè)圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of amplified products of 5.8S rDNA sequences from isolated yeasts

2.3.2 部分酵母菌菌株的5.8S rDNA片段測(cè)序及入庫(kù)比對(duì)結(jié)果

圖3 菌株12 5.8S rDNA序列同源性分析Fig.3 Homology analysis of strain 12 and relative strains based on 5.8S rDNA sequence

圖4 菌株12的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain 12

將擴(kuò)增成功的酵母菌菌株的PCR產(chǎn)物送北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取序列最為接近的菌種。測(cè)序結(jié)果采用DNA Star軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖3、4所示，菌株12與標(biāo)準(zhǔn)菌株(HQ396523.1)相似率為96%，為Kluyveromyces marxianus CHY1612菌。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從新疆哈薩克族傳統(tǒng)自制酸馬奶中分離純化、鑒定酵母菌菌株34株，共10個(gè)屬，分別為Schizosaccharomyces、Sehizoblastosporion、Torulopsis、Saccharomycodes、Kloechera、Kluveromyces、Dekker、Trichosporon、Hansenula、Brettanomyces。采用傳統(tǒng)鑒定方法對(duì)34株菌進(jìn)行種屬鑒定，并對(duì)菌株12進(jìn)行了5.8S rDNA序列分析。結(jié)果表明，雖然表型特征、生理生化特性是酵母菌分類(lèi)的重要指標(biāo)，但傳統(tǒng)分類(lèi)方法用于準(zhǔn)確鑒定酵母菌并不容易，通常需要大量的生理生化實(shí)驗(yàn)[11-15]，采用5.8S rDNA分析鑒定酵母菌，準(zhǔn)確率可達(dá)96%～99%。利用5.8S rDNA序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析對(duì)菌株12進(jìn)行了分子鑒定，鑒定結(jié)果為菌株12與標(biāo)準(zhǔn)菌株HQ396523.1同源性達(dá)到96%，與傳統(tǒng)生理生化特性鑒定結(jié)果一致。結(jié)果表明，5.8S rDNA序列分析應(yīng)于酵母菌鑒定具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高、鑒定速度快的特點(diǎn)[12]，是一種區(qū)別、鑒定酵母菌很有效的方法[13-15]。

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Isolation and Identification of Yeasts from Koumiss as a Traditional Kazakh Fermented Drink in Xinjiang

LI Jing，JIA Jia-jia，YANG Yan，TIAN Yan，WU Yun.*...
(College of Food Science and Pharmaceutical Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China)

In this study, 34 stains of yeasts were isolated from koumiss (a traditional fermented Kazakh drink in Xinjiang)sampled from Nanshan, Shuixigou and Zhaosu. According to the colonial morphology and biological properties, the strains were identified to consist of 1 stain of Schizosaccharomyces, 1 stain of Sehizoblastosporion, 1 stain of Torulopsis, 1 stain of Saccharomycodes, 9 stains of Kloechera, 5 stains of Kluyveromyces, 8 stains of Dekker, 3 stains of Trichosporon, 2 stains of Hansenula, and 3 stains of Brettanomyces. Strain 12 was further identified by 5.8S rDNA sequencing and phylogenetic tree analysis.The homology between the strain and Kluyveromyces marxianus was 96%. This was consistent with the results of identification based on morphological and biochemical properties, showing that yeast identification based on 5.8S rDNA sequences is accurate.

koumiss；yeast；isolation and identification；molecular biology

TS201.3

A

1002-6630(2012)05-0203-05

2011-10-30

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(200803033-A09011)；新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(201191238)；新疆維吾爾自治區(qū)重大專(zhuān)項(xiàng)(201130101-4)；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)緊缺人才專(zhuān)業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目

李靜(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：lijing_2010@sina.cn

武運(yùn)(1965—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與食品安全。E-mail：wuyunster@sina.com