海藻酸鈉固定靈芝細(xì)胞對(duì)胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響

董玉瑋，湯步偉，苗敬芝，曹澤虹

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

海藻酸鈉固定靈芝細(xì)胞對(duì)胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響

董玉瑋，湯步偉，苗敬芝，曹澤虹

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

采用海藻酸鈉和氯化鈣對(duì)靈芝細(xì)胞進(jìn)行固定，研究包埋法固定靈芝細(xì)胞的工藝條件，探討固定化工藝對(duì)靈芝胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：固定靈芝細(xì)胞的最佳工藝條件為：4.5%海藻酸鈉、2.2% CaCl2、培養(yǎng)基pH值自然，接種40個(gè)固定化小球，28℃、110r/min培養(yǎng)12d，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量為(49.53±1.37)×10-2mg/mL。固定化靈芝細(xì)胞較未固定細(xì)胞，具有更好的耐酸、耐堿性，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)仍具有較高的產(chǎn)三萜類(lèi)能力，回收利用次數(shù)可達(dá)5次。

靈芝；三萜類(lèi)；固定化；海藻酸鈉；氯化鈣

被譽(yù)為“四大菌王”、“九大仙草”之一的靈芝(Ganoderma lucidum)，作為藥食兼用的瑰寶，近年來(lái)，隨著靈芝子實(shí)體的栽培和菌體生物發(fā)酵的生產(chǎn)，使得靈芝在中藥、保健品、功能性食品上的應(yīng)用更為普遍[1]。三萜類(lèi)作為靈芝保肝、抗腫瘤的重要活性物質(zhì)[2-3]，目前已分離到100多種，其產(chǎn)量已成為鑒定靈芝品種優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一[4]。傳統(tǒng)靈芝栽培工藝受季節(jié)和原材料的限制，子實(shí)體產(chǎn)量低，不能滿足需要；單一的液體發(fā)酵技術(shù)雖然可以在一定程度上提高靈芝活性物質(zhì)產(chǎn)量，但也存在投入成本高、產(chǎn)量不穩(wěn)定等不足。固定化細(xì)胞技術(shù)是液體發(fā)酵技術(shù)與固定化酶技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，是利用物理或化學(xué)手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活性可以反復(fù)使用的一種技術(shù)，較液體發(fā)酵技術(shù)，可以提高微生物的催化活性，縮短生產(chǎn)周期，降低成本，增加產(chǎn)量，因而工業(yè)化生產(chǎn)前景廣闊[5-7]。固定化真菌細(xì)胞技術(shù)已取得一些研究成果，凸顯出很多優(yōu)勢(shì)[8-9]，但該項(xiàng)技術(shù)在靈芝上的應(yīng)用還極少。本實(shí)驗(yàn)探討固定化靈芝細(xì)胞的工藝條件，及其對(duì)三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響，為合理開(kāi)發(fā)靈芝資源，提高靈芝三萜類(lèi)產(chǎn)量提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

赤靈芝003為徐州工程學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的高產(chǎn)三萜類(lèi)菌株；馬鈴薯 市售。

PDA斜面培養(yǎng)基：按照GB 4789.15—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》配制，用于菌種的復(fù)蘇及保存；可溶性淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉3%、酵母膏1%、葡萄糖1.2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%；再生培養(yǎng)基：蛋白胨0.1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.5%、KH2PO40.046%、K2HPO40.1%、瓊脂2%、VB2和VB6少量[10]。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 昆明科翔生物科技有限公司；所用其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

取一小塊菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)144h，活化1次。接種活化后的菌塊于可溶性淀粉培養(yǎng)基中，250mL搖瓶80mL裝液量，28℃、110r/min搖床培養(yǎng)5 d。

1.2.2 靈芝細(xì)胞的固定化

選取長(zhǎng)勢(shì)較好的靈芝菌絲，放入玻璃珠打散細(xì)胞后，加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻酸鈉溶液(V靈芝菌液:V海藻酸鈉溶液＝1:3)，充分混勻后，用7號(hào)針頭吸取混合液滴入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CaCl2溶液中，形成固定化小球，直徑約2～3mm，放入4℃冰箱靜置2h，再放入28℃恒溫箱2h固定完全。取出后用甘露醇溶液沖洗2次，濾紙吸干后放入可溶性淀粉培養(yǎng)基，250mL搖瓶80mL裝液量，28℃、110r/min搖床培養(yǎng)一定時(shí)間[11]。

1.2.3 靈芝胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的測(cè)定

1.2.3.1 胞外三萜類(lèi)的提取

正丁醇中加蒸餾水于分液漏斗中充分混勻，靜置過(guò)夜，上層即為水飽和正丁醇。取發(fā)酵液15mL，用3倍體積的水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，減壓蒸干，加4mL 95%乙醇溶解，備用[12]。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱取10mg齊墩果酸，置于50mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度。取試管6支，分別加入齊墩果酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，用甲醇補(bǔ)至1mL，加5%香草醛溶液(香草醛5g，加入冰醋酸100mL溶解)2mL，高氯酸5mL，混勻后60℃水浴20min，置涼水中15min，各加冰醋酸5mL，于波長(zhǎng)550nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 比色法測(cè)定三萜類(lèi)產(chǎn)量

分別取待測(cè)樣品溶液1mL于試管中(設(shè)3個(gè)重復(fù))，加5%香草醛溶液2mL、高氯酸5mL混勻后，60℃水浴20min，置涼水中15min，加冰醋酸5mL，于波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸光度[12]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靈芝胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻酸鈉對(duì)胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響

分別取3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%的海藻酸鈉溶液，2.1%氯化鈣，pH值自然，制備固定化細(xì)胞小球。接種50個(gè)固定化小球于可溶性淀粉培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)11d，測(cè)定胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on extracellular triterpene yield

從圖1可以看出，隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量先增大后減小。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于4.5%時(shí)，固定化小球較易破裂，被固定化的靈芝菌絲新陳代謝較快，容易衰老，因此三萜類(lèi)產(chǎn)量較少。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于4.5%時(shí)，固定化小球阻礙了細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，三萜類(lèi)產(chǎn)量也較低。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%時(shí)，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量最高，為47.20×10-2mg/mL。

2.2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈣對(duì)胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響

分別取1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%的氯化鈣溶液，4.5%的海藻酸鈉溶液，pH值自然，制備固定化細(xì)胞小球。接種50個(gè)固定化小球于可溶性淀粉培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)11d，測(cè)定胞外三萜類(lèi)的產(chǎn)量，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of calcium chloride concentration on extracellular triterpenoid yield

從圖2可以看出，隨著氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量先增大后減小。當(dāng)氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于2.2%時(shí)，海藻酸鈣外壁較薄，菌絲新陳代謝較快，易衰老，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量較少。當(dāng)氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2.2%時(shí)，海藻酸鈣外壁較厚，不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量較少。當(dāng)氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.2%時(shí)，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量最高，為48.48×10-2mg/mL。

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)未固定化、固定化靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響

采用4.5%海藻酸鈉和2.2%氯化鈣對(duì)靈芝細(xì)胞進(jìn)行固定化，pH值自然，接種50個(gè)固定化小球于可溶性淀粉培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)，分別測(cè)定未固定化、固定化靈芝細(xì)胞4～16d時(shí)胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)固定化前后靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of culture time on extracellular triterpenoid yield of nonimmobilized and immobilized Ganoderma lucidum

從圖3可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化、未固定化靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量都先增大后減小，分別在第12、9天，三萜類(lèi)產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為48.13×10-2mg/mL 和30.26×10-2mg/mL。固定化靈芝細(xì)胞培養(yǎng)前期(4～8d)，細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，海藻酸鈣白色鈣化外壁明顯，三萜類(lèi)產(chǎn)量較少，且低于未固定化細(xì)胞，這是由于固定化工藝會(huì)在一定程度上損傷細(xì)胞，影響其生長(zhǎng)，細(xì)胞需要一定時(shí)間適應(yīng)固定化后的環(huán)境；培養(yǎng)中期(9～13d)，海藻酸鈣白色鈣化外壁透明度、光澤度增加，固定化小球直徑增大，表明靈芝細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)固定后的生長(zhǎng)環(huán)境，活性增加，三萜類(lèi)產(chǎn)量增加明顯，高于未固定化細(xì)胞；培養(yǎng)后期(14～16d)，海藻酸鈣外壁更加通透、稀薄，細(xì)胞老化程度加劇，形成的三萜類(lèi)物質(zhì)也逐漸被細(xì)胞作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)重新吸收利用，培養(yǎng)液黏稠度增加，生長(zhǎng)環(huán)境質(zhì)量下降，三萜類(lèi)產(chǎn)量逐漸降低，但仍高于未固定化細(xì)胞。

2.4 pH值對(duì)未固定化、固定化靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響

分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為1.5～12.5，采用4.5%海藻酸鈉和2.2%氯化鈣對(duì)靈芝細(xì)胞進(jìn)行固定化，接種50個(gè)固定化小球于可溶性淀粉培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)12d，未固定化細(xì)胞28℃培養(yǎng)9d，分別測(cè)定未固定化、固定化靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)固定化前后靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of culture pH on extracellular triterpenoid yield of nonimmobilized and immobilized Ganoderma lucidum

從圖4可以看出，隨著pH值增加，未固定化、固定化靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量都先增大后減小，都在pH5.5(培養(yǎng)基自然pH值)時(shí)，達(dá)到最高，分別為30.26×10-2mg/mL 和49.17×10-2mg/mL。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性條件對(duì)靈芝細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用，固定化后在一定程度上可以保護(hù)細(xì)胞，因此相同pH值條件下，固定化后靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量都高于未固定化細(xì)胞，表現(xiàn)出較好的耐酸、耐堿性。但是當(dāng)pH值大于6.5后，由于氫離子減少，古羅糖醛酸與甘露糖醛酸不足以形成分子間橋聯(lián)[13]，所以堿性條件對(duì)固定化細(xì)胞影響較大，三萜類(lèi)產(chǎn)量減少明顯。

2.5 回收次數(shù)對(duì)固定化靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響采用4.5%海藻酸鈉，2.2% CaCl2，pH值自然，接種50個(gè)固定化小球于可溶性淀粉培養(yǎng)基，每次28℃培養(yǎng)

12d，取出固定化小球，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，測(cè)定每次發(fā)酵液胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 回收次數(shù)對(duì)固定化靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of repeated use on extracellular triterpenoid yield of immobilized Ganoderma lucidum

從圖5可以看出，回收5次后，固定化靈芝細(xì)胞仍然具有一定的產(chǎn)胞外三萜類(lèi)的能力，可回收性能良好。隨著回收次數(shù)增加，不斷有固定化小球發(fā)生破裂，尤其是回收3次以后，破裂數(shù)明顯增多，同時(shí)小球體積增大，第5次回收后，小球直徑均在1.5～2.5cm，海藻酸鈣膨脹能力已近極限，因此第6次回收后，剩余固定化小球在培養(yǎng)過(guò)程中均破裂，但游離細(xì)胞仍具有產(chǎn)胞外三萜類(lèi)的能力，因此仍可測(cè)出胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量。2.6 接種量對(duì)固定化靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響

采用4.5%海藻酸鈉，2.2%氯化鈣固定靈芝細(xì)胞，pH值自然，分別接種10、20、30、40、50、60、70個(gè)固定化小球，28℃培養(yǎng)12d，測(cè)定胞外三萜類(lèi)的產(chǎn)量，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 接種量對(duì)固定化靈芝細(xì)胞胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of inoculum size on extracellular triterpenoids yield of immobilized Ganoderma lucidum

從圖6可以看出，隨著接種量的增加，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量先增大后減小，接種量較低時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度慢，接種量高則會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，氧氣急劇消耗，造成生長(zhǎng)過(guò)剩，不利于胞外三萜類(lèi)的積累，當(dāng)接種40個(gè)固定化小球時(shí)，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量達(dá)到最高，為47.01×10-2mg/mL。2.7 固定化靈芝細(xì)胞最佳條件

圖7 最佳固定化工藝條件下的靈芝菌球形態(tài)Fig.7 Mycelium pellets of Ganoderma lucidum immobilized under optimum conditions

根據(jù)海藻酸鈉固定化靈芝細(xì)胞的最佳工藝條件：4.5%海藻酸鈉，2.2% CaCl2，pH值自然，接種40個(gè)固定化小球，28℃、250mL搖瓶80mL裝液量，110r/min培養(yǎng)12d，重復(fù)3次，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量為(49.53±1.37)×10-2mg/mL，固定化靈芝菌球形態(tài)見(jiàn)圖7。固定化小球平均半徑約為3～4mm，大小均一，透明度、光澤度較好。由于固定化工藝能夠形成高度密集而體積小的生產(chǎn)菌集合體，同時(shí)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和海藻酸鈣載體都存在著擴(kuò)散限制作用，有利于集中、高效的利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此固定化后細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖能力提高，抗逆性增強(qiáng)，老化速度降低，細(xì)胞壽命延長(zhǎng)，穩(wěn)定性增加，可長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用。

3 結(jié) 論

海藻酸鈉固定靈芝細(xì)胞最佳工藝條件為：4.5%海藻酸鈉，2.2% CaCl2，pH值自然，接種40個(gè)固定化小球，28℃、250mL搖瓶80mL裝液量，110r/min培養(yǎng)12d，胞外三萜類(lèi)產(chǎn)量為49.53×10-2mg/mL。固定化靈芝細(xì)胞較未固定細(xì)胞具有更好的耐酸、耐堿性，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)仍具有較高的產(chǎn)胞外三萜類(lèi)能力，回收利用次數(shù)可達(dá)5次。

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Immobilization of Ganoderma lucidum in Sodium Alginate Beads and Effect on Extracellular Triterpene Production

DONG Yu-wei，TANG Bu-wei，MIAO Jing-zhi，CAO Ze-hong
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

In this study, Ganoderma lucidum were immobilized by sodium alginate and calcium chloride. Immobilization conditions of Ganoderma lucidum using entrapment method were studied. The effects of immobilization conditions on triterpenes yield were also evaluated. The results showed the optimal conditions of immobilization of Ganoderma lucidum by sodium alginate were as follows: 4.5% of sodium alginate, 2.2% of calcium chloride, nature pH, 40 immobilized beads, 28 ℃, 110 r/min, cultured 12 days, the highest triterpenes yield was (49.53±1.37)×10-2mg/mL. Immobilized cells had better acid and alkali resistance,higher triterpenes yield after long time culture than non-immobilized cell. It can be recycled five times.

Ganoderma lucidum；triterpenoids；immobilization；sodium alginate；calcium chloride

TS201.3

A

1002-6630(2012)05-0234-04

2011-04-11

江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(09KJD180008)；徐州工程學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目(XKY2008228)

董玉瑋(1980—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：dongyuwei66@163.com