一種新型補(bǔ)充礦物元素的載體
——脫鐵鐵蛋白的研究進(jìn)展

王 震，冷小京*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

一種新型補(bǔ)充礦物元素的載體
——脫鐵鐵蛋白的研究進(jìn)展

王 震，冷小京*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

鐵蛋白(ferritin)經(jīng)脫鐵處理后，內(nèi)部空腔可裝載多種礦物元素。鑒于這種蛋白可經(jīng)胞飲作用，完整地被小腸上皮細(xì)胞吸收，因此有望作為新型礦物元素載體而發(fā)展。脫鐵鐵蛋白(apoferritin)的脫鐵及礦物元素的裝載過程可利用透射電鏡(TEM)、能譜分析(EDS)、X射線粉末衍射(X-Ray)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、紫外分光光度法(UV)等技術(shù)研究分析。本文綜述了目前國內(nèi)外利用鐵蛋白裝載礦物元素的成果及其在營養(yǎng)方面的應(yīng)用。

鐵蛋白；脫鐵鐵蛋白；礦物元素；載體

礦物元素與人的生命和健康息息相關(guān)，如作為酶的組分起催化作用，參與激素作用調(diào)節(jié)生物功能，影響核酸的代謝，影響生物物理效應(yīng)等[1]；其攝入過量或不足都會(huì)不同程度地引發(fā)人體生理代謝異?；?qū)е录膊　Ｈ梭w所需的礦物元素涉及多種過渡族元素，如F e、Cu、Zn、Co、Mn、Ni等，這些元素極易發(fā)生中和、沉淀、或絡(luò)合等反應(yīng)，而C a、Z n、C u、M g、F e等金屬離子也易與磷酸根、蛋白質(zhì)形成低溶解度的絡(luò)合物，從而影響礦物質(zhì)元素的人體吸收利用率[2]。解決上述問題的傳統(tǒng)方法是通過化學(xué)手段，促使礦物元素與特定有機(jī)成分反應(yīng)形成配合物來增加溶解度，提高可利用性。利用脫鐵鐵蛋白(apoferritin)的空腔制備新型生物納米運(yùn)載體系，通過胞吞作用被人體吸收，是一種全新的生物技術(shù)，因此引起國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域極大關(guān)注。

鐵蛋白最初發(fā)現(xiàn)于脊椎動(dòng)物的肝臟、脾臟等器官中，后確認(rèn)這是種廣泛存在于動(dòng)物及植物等幾乎所有生命體中的一類鐵儲(chǔ)藏蛋白，它的功能主要是儲(chǔ)藏和隔離鐵，調(diào)節(jié)鐵離子的代謝。鐵蛋白可以結(jié)合許多金屬離子[3]，而且是第一個(gè)被用作模板合成金屬顆粒的蛋白質(zhì)[4]。天然鐵蛋白是一種良好的補(bǔ)鐵試劑，在補(bǔ)鐵實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其對(duì)人體無毒害作用[5]。鐵蛋白結(jié)合到腸細(xì)胞表面受體后，通過胞吞作用可完整的轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部利用。將鐵蛋白內(nèi)部的鐵核在無氧環(huán)境下通過還原反應(yīng)除去得到Apoferritin，之后使用化學(xué)方法將其他礦物質(zhì)離子加入Apoferritin體系，可形成新型生物納米顆粒。礦物質(zhì)進(jìn)入脫鐵鐵蛋白的過程可使用電鏡、能譜分析、粉末衍射、質(zhì)譜、核磁共振、動(dòng)態(tài)光散射、紫外分光光度法等方法研究。

1 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

鐵蛋白是由24個(gè)亞基組成的類球狀蛋白分子，內(nèi)徑約為8nm，外徑約12nm。鐵蛋白的亞基主要包括兩種類型：重鏈(H)和輕鏈(L)，每個(gè)亞基包括 5個(gè)α螺旋，即從N端起形成4個(gè)α螺旋(A、B、C、D)，C末端由第5個(gè)較短α螺旋(E)構(gòu)成[6-7]；24個(gè)亞基構(gòu)成一個(gè)呈432點(diǎn)對(duì)稱的菱形十二面體蛋白質(zhì)外殼。在該十二面體上沿二、三、四重旋轉(zhuǎn)軸分別可得由亞基組成的12個(gè)2倍軸通道，8個(gè)3倍軸通道和6個(gè)4倍軸通道(圖1)，負(fù)責(zé)鐵蛋白內(nèi)外物質(zhì)的交換[8]。在植物鐵蛋白中，3倍軸和4倍軸通道都是親水性的，而在動(dòng)物鐵蛋白中，3倍軸通道由親水性殘基組成，4倍軸通道由疏水性殘基組成[9]。

圖1 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of ferritin

1.2 鐵蛋白的功能特性

當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Fe2＋濃度高時(shí)，鐵蛋白催化Fe2＋被氧氣分子氧化，并把生成的Fe3＋儲(chǔ)藏于其內(nèi)部空腔，1分子鐵蛋白最多可儲(chǔ)存4500個(gè)Fe3＋。當(dāng)細(xì)胞需要鐵時(shí)，即Fe2＋濃度低時(shí)，鐵蛋白在還原劑的幫助下將Fe3＋還原為Fe2＋，將鐵從其內(nèi)部釋放出來供其他代謝所利用。因此，鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)具有去除Fe2＋的毒性以及調(diào)節(jié)鐵代謝平衡的雙重作用[8]。

1.3 鐵蛋白的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)

鐵蛋白通道及空腔內(nèi)部有許多帶負(fù)電的氨基酸殘基都可結(jié)合金屬離子，如人體鐵蛋白H鏈上組成通道中親水區(qū)域的Glu 27、Glu61、Glu 62、Glu 107和Gln 141和馬脾鐵蛋白的L鏈中指向內(nèi)部空腔的Glu 60、Glu 61[10]等；其他帶負(fù)電的氨基酸殘基如Asp也可通過靜電作用結(jié)合金屬離子。鐵蛋白通道中負(fù)電氨基酸殘基可構(gòu)成電勢(shì)梯度，金屬離子可順著電勢(shì)轉(zhuǎn)運(yùn)到鐵蛋白內(nèi)部[11]。

2 鐵蛋白裝載的礦物元素

2.1 礦物離子的種類

鐵蛋白內(nèi)部可結(jié)合多種金屬離子如Fe2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Pt2+等[3]。鐵蛋白的鐵核可利用Apoferritin在體外合成[12]，且大小分布均一，為(7.3±1.4)nm，與天然鐵核相似。目前已合成的金屬納米顆粒有：ZnSe[13]、Mn(O)OH和Mn3O4[14]、Co(O)OH和Co3O4[15]、Cr(OH)3、Ni(OH)3[16]、Eu(O)OH、In2O3、TiO2[17]、FeS、CdS[18]、CdSe[19]等。鐵蛋白的礦化成核作用不具有專一性，說明導(dǎo)致金屬陽離子進(jìn)入空腔內(nèi)部的主要起因是靜電作用。在ZnSe的合成中，Zn2+需先于Se2-加入與Apoferritin反應(yīng)，也可通過蛋白質(zhì)的靜電導(dǎo)向作用來描述。Apoferritin內(nèi)表面負(fù)電殘基首先結(jié)合帶正電的Zn2+，然后陰離子Se2-進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)部再與Zn2+結(jié)合。借助Apoferritin內(nèi)部金屬離子還原的方法，還可進(jìn)一步合成金屬單質(zhì)顆粒[13]等。

2.2 礦物核心的形成

鐵蛋白的3倍軸、4倍軸通道直徑為0.3～0.4nm，金屬離子通過擴(kuò)散作用可進(jìn)入Apoferritin內(nèi)部，結(jié)合到帶負(fù)電的氨基酸殘基位點(diǎn)，然后通過一定作用成晶核，逐漸長大至粒徑大小約為8nm——即鐵蛋白內(nèi)徑。金屬納米顆粒的形成可分兩種類型(圖2)。

圖2 Apoferritin 內(nèi)合成的金屬納米顆粒Fig.2 Synthesis of metal nanoparticles in apoferritin

類型一：金屬離子在鐵蛋白內(nèi)部沉淀成核，如Wong等[18]合成CdS的方法 (圖2A)：在氮?dú)猸h(huán)境中，向1mg/mL Apoferritin加入Cd2+(Cd2+與Apoferritin物質(zhì)的量比為55)，1h后加入HS－(HS－與Cd2+物質(zhì)的量比為2.5)反應(yīng)45min，再加入HS－(HS－與Cd2+物質(zhì)的量比為2.5)反應(yīng)45～60min，最后在緩沖液中(pH 7.5的TES/ NaCl)透析除去游離的Cd2+或HS－。重復(fù)此過程，使CdS 顆粒在Apoferritin 空腔內(nèi)長大。

類型二：金屬離子在鐵蛋白內(nèi)部通過氧化還原反應(yīng)成核，如Galvez 等[20]合成Cu的方法 (圖2B)：向0.1mL CuSO4(0.1mol/L)溶液中加入4mL Apoferritin(40μmol/L) ，使Cu與Apoferritin 的物質(zhì)的量比達(dá)到2000。Apoferritin與Cu2+復(fù)合物通過分子篩層析色譜柱(G-25 Sephadex)分離純化，然后向溶液中加入還原劑NaBH4，將Apoferritin內(nèi)的Cu2+還原為銅單質(zhì)。體系在4℃條件下反應(yīng)24h，pH值穩(wěn)定在8左右。

使用脫鐵鐵蛋白合成金屬納米顆粒的過程需要控制pH值、溫度等條件。與Apoferritin結(jié)合的金屬離子數(shù)量受pH值的影響。如Pead等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在pH7.5時(shí)，每個(gè)Apoferritin分子可結(jié)合Cd2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+的數(shù)量分別為54、33、30、16，而在pH5.5時(shí)結(jié)合的數(shù)量分別為3、29、1.5、1。由此可見，pH值的升高可增加Apoferritin所帶負(fù)電荷量，增強(qiáng)靜電吸引作用，結(jié)合更多的金屬離子。鐵蛋白的結(jié)構(gòu)變化，如亞基的解離，也會(huì)受pH值的影響，因此為保證鐵蛋白的穩(wěn)定性，研究中需要將pH值控制在適當(dāng)范圍內(nèi)。這一特性也可用于礦物元素的裝載。利用pH2.0時(shí)鐵蛋白亞基解離，pH7.5時(shí)亞基可重新聚集的特性來裝載鉑金屬[21-22]。金屬離子與鐵蛋白的結(jié)合在低溫下反應(yīng)平衡時(shí)間增長，高溫時(shí)變短。溫度的提高有助于小分子進(jìn)入鐵蛋白的擴(kuò)散以及聚集效果。在20～40℃之間，硝基氧分子進(jìn)入馬脾鐵蛋白的速率每升高10℃可增加一倍。

2.3 礦物離子及納米顆粒的研究方法

分子篩層析色譜法分離純化、紫外分光及原子吸收法的聯(lián)用，經(jīng)常用于判斷蛋白質(zhì)與金屬離子的結(jié)合。在含Ag的Apoferritin的洗脫曲線中存在兩個(gè)原子吸收峰[18,20]，Galvez 等[20]認(rèn)為，第一個(gè)峰與蛋白質(zhì)在280nm處的吸收峰同時(shí)出現(xiàn)，表明Apoferritin與Ag的結(jié)合，而第二個(gè)峰表示未與蛋白質(zhì)結(jié)合的游離Ag。而通過純Apoferritin與載有金屬的Apoferritin天然聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶的比較，可驗(yàn)證裝載金屬離子后的Apoferritin的分子是否依舊完整[21]，兩者條帶相同表示裝載金屬離子的鐵蛋白結(jié)構(gòu)沒有改變。

透射電鏡(TEM)是研究鐵蛋白合成納米顆粒的直觀手段，將濃度0.1μmol/L的鐵蛋白溶液滴于鍍有碳膜的銅網(wǎng)或金網(wǎng)上，用醋酸鈾?；蛄蚪鸫咸翘侨旧?，在室溫下干燥后即可觀測(cè)[20]。Yamashita等[23]利用它觀測(cè)礦化核及負(fù)染色后的鐵蛋白殼，從而證明礦化核是在鐵蛋白內(nèi)部形成的。如圖3(比例尺為30nm)，黑色圓點(diǎn)是金屬礦化核，環(huán)繞周圍的是鐵蛋白殼。染色劑硫金代葡萄糖分子質(zhì)量較大，無法通過鐵蛋白殼上的通道進(jìn)入內(nèi)部，因此可用來研究蛋白殼內(nèi)核的形成。對(duì)于粒徑分布均勻的類球形鐵蛋白，使用TEM可直接測(cè)量顆粒的真實(shí)粒徑[20]。Kim等[24]使用電鏡研究Co3O4、CoOOH納米顆粒的形成，觀測(cè)到Co首先形成有空腔的礦化核，然后礦化核變?yōu)閷?shí)心的球體。需要注意的是，當(dāng)Apoferritin內(nèi)的金屬離子濃度過低，導(dǎo)致樣品電子密度過低時(shí)，圖像分辨率會(huì)受到很大影響。在Wong等[18]合成CdS過程中，若Cd2+與Apoferritin物質(zhì)的量比低于110時(shí)，顆粒為灰白色，觀測(cè)不到礦物質(zhì)內(nèi)核。

圖3 鐵蛋白內(nèi)Fe、Co、Ni氧化物的透射電鏡照片F(xiàn)ig.3 Transmission electron micrographs of iron oxide, cobalt oxide and nickel oxide in ferritin

Galvez 等[25]將EDS能譜分析技術(shù)與TEM聯(lián)用，檢測(cè)納米顆粒的成分及含量，如通過檢測(cè)蛋白殼內(nèi)外Co的含量，可證明合成的金屬Co核存在于蛋白殼內(nèi)部。Tosha 等[26]利用X射線粉末衍射(X-Ray)技術(shù)，可分辨納米顆粒的晶體構(gòu)造。Wong等[18]利用核磁共振法(NMR)監(jiān)測(cè)了Fe2＋與Apoferritin的結(jié)合，以及鐵氧化物在蛋白空腔內(nèi)部形成的過程。他們發(fā)現(xiàn)，1個(gè)Apoferritin首先結(jié)合12個(gè)Fe2＋，然后才在其內(nèi)部形成Fe2O3沉淀，進(jìn)而形成Fe2O3核。Li Chaorui等[27]利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(DLS)在水環(huán)境下測(cè)定納米顆粒的水合粒徑，以及反應(yīng)裝載金屬離子后鐵蛋白大小的變化及聚集等特征。

3 載有礦物元素的鐵蛋白的應(yīng)用

4 展 望

人體需要多種礦物元素，以保持正常的生命活動(dòng)，但它們的吸收利用受諸多因素影響，如沉淀、螯合等。鐵蛋白作為一種新型生物納米載體可裝載許多礦物營養(yǎng)因子，并保持它們的功能活性。鐵蛋白可溶，易吸收，其能夠保護(hù)礦物元素免受外界不良影響，完整地轉(zhuǎn)運(yùn)到小腸上皮細(xì)胞內(nèi)等特性，可有效增加礦物元素的生物利用率。不過，有關(guān)使用改性技術(shù)制備的鐵蛋白載體毒理方面的研究尚不充分，有待繼續(xù)探討。目前，有關(guān)鐵蛋白裝載金屬離子的研究越來越廣泛，隨著對(duì)鐵蛋白裝載金屬離子機(jī)制以及被人體利用途徑研究的深入，鐵蛋白運(yùn)載將成為一種具有獨(dú)特功效的補(bǔ)充礦物元素的技術(shù)。

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Ferritin: A New Mineral Carrier for Supplement

WANG Zhen，LENG Xiao-jing* (College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The cavity of apoferritin can be used to transport various minerals. Since this protein can be absorbed by intestinal epithelial cells via entocytosis pathways, it becomes a new promising type of mineral nanocarrier. The process of deferrization for ferritin and mineral loading has been studied by transmission electron microscope (TEM), energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS), X-ray powder diffraction (X-Ray), mass spectroscopy (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), dynamic light scattering (DLS) and ultraviolet spectroscopy (UV), respectively. Recents applications of apoferritin carriers in the field of nutrition are summarized in this paper.

ferritin；apoferritin；mineral；carrier

R151.3

A

1002-6630(2012)01-0290-04

2011-01-16

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD23B04)

王震(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)殍F蛋白功能特性。E-mail：wangzhen022078@163.com

*通信作者：冷小京(1966—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)榭墒秤媚ぜ拔⒛z囊科學(xué)。E-mail：xiaojing.leng@gmail.com