一株致病性奇異變形桿菌的分離與鑒定

曲信芹 穆曉惠 李甜甜

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇 揚(yáng)州 225009）

變形桿菌（proteusbacillus vulgaris）是人和動(dòng)物的寄生菌和病原菌。廣泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、腐敗有機(jī)物及人或動(dòng)物的腸道內(nèi)。變形桿菌屬于腸桿菌科，包括普通變形桿菌、奇異變形桿菌、莫根變形桿菌、雷極變形桿菌和無恒變形桿菌[1]。變形桿菌呈明顯的多形性，有球形和絲狀形，為周鞭毛菌，運(yùn)動(dòng)活潑。有菌毛，可粘附于植物和真菌細(xì)菌表面，但不吸附動(dòng)物組織細(xì)胞和紅細(xì)胞。變形桿菌為條件致病菌，多為繼發(fā)感染，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，可引起人及動(dòng)物的創(chuàng)傷感染、膀胱炎、尿道炎、敗血癥、食物中毒等，一般健康人群帶菌率為1.3%～10.4%[2]。奇異變形桿菌引起的感染有日益增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在美國，醫(yī)院內(nèi)感染率約為3%[3]。因此，快速準(zhǔn)確地做出診斷，對(duì)致病性變形桿菌的防控有重要的意義。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的病原學(xué)方法及16S rDNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合起來進(jìn)行菌株的鑒定，從臨床采集的病料中分離出一株致病性奇異變形桿菌。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

病料來自于江蘇某規(guī)模化豬場(chǎng)，無菌取某豬的肺臟、肺門淋巴結(jié)作為待檢材料。

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為普通營養(yǎng)瓊脂平板、普通營養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂平板、血瓊脂平板等按常規(guī)方法配制。

1.3 細(xì)菌學(xué)鑒定

1.3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將無菌采集的病豬肺及肺門淋巴結(jié)分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，分別在有氧和厭氧條件下37℃培養(yǎng)24h，挑去優(yōu)勢(shì)菌落再分別接種于以上四種培養(yǎng)基直至得到菌落形態(tài)和鏡檢菌體形態(tài)一致的純培養(yǎng)物。

1.3.2 細(xì)菌形態(tài)觀察 將純培養(yǎng)物按常規(guī)方法[4]進(jìn)行革蘭氏染色、顯微鏡觀察。

1.3.3 生化鑒定 將培養(yǎng)24h的菌液按常量接種于生化微量鑒定管內(nèi)，37℃培養(yǎng)，觀察并記錄結(jié)果。

1.3.4 藥敏試驗(yàn) 采用標(biāo)準(zhǔn)的抗生素紙片法[5]，按2003年美國NCCLS（美國國立臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)）藥敏試驗(yàn)法規(guī)進(jìn)行。

1.3.5 16SrDNA的擴(kuò)增及序列測(cè)定 從平板上挑取少許單菌落，移入LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，取1ml新鮮菌液，離心收集菌體，用超純水重懸，煮沸冰浴后離心，其上清即為細(xì)菌的DNA。然后按照PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的試劑盒（購自Takara公司）將該菌的16SrDNA前500bp進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16SrDNA的前500 bp序列變化較大，包含有豐富的細(xì)菌種屬的特異性信息，進(jìn)行DNA測(cè)序時(shí)一個(gè)測(cè)序反應(yīng)即可測(cè)通，是一種較為經(jīng)濟(jì)便捷的16SrDNA鑒定方法。反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，鑒定正確后根據(jù)膠回收試劑盒的操作說明進(jìn)行純化，然后送上海生工測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)特性

該分離菌在有氧和厭氧條件下均能生長(zhǎng)，打開平皿時(shí)具有腐敗氣味。在普通營養(yǎng)瓊脂平板上和血瓊脂平板上，菌落呈圓形，半透明的呈薄膜擴(kuò)散狀生長(zhǎng)，對(duì)光觀察，菌落周圍呈淡藍(lán)色，血平板上不產(chǎn)生溶血；在麥康凱上長(zhǎng)出均勻圓形、扁平、半透明的單個(gè)無色菌落；在普通營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)基混濁液面可見菌膜，管底有少量沉淀。

2.2 細(xì)菌形態(tài)

經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢可觀察到，該分離菌為革蘭氏陰性，兩端鈍圓，呈單個(gè)或成對(duì)的球狀、球桿狀、長(zhǎng)絲狀等多形態(tài)的桿菌。

2.3 生化特性

表1 分離菌的生化反應(yīng)結(jié)果

2.4 藥物敏感試驗(yàn)

分離菌對(duì)慶大霉素，新霉素，四環(huán)素，氯霉素，卡那霉素，鏈霉素，氨芐霉素等多種抗生素均不敏感，僅對(duì)阿米卡星敏感，顯示多重耐藥性。

根據(jù)以上該菌的形態(tài)，培養(yǎng)和生化特性及藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可初步判定該菌為奇異變形桿菌。

2.5 16SrDNA擴(kuò)增結(jié)果及序列分析

圖1 分離菌16SrDNA前500bpPCR擴(kuò)增的結(jié)果1為陰性對(duì)照；2為該分離菌；3為100bpDNA Ladder Maker。

將這株菌的16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果提交到GenBank，與GenBank中相關(guān)序列的BLAST比較，結(jié)果表明與奇異變形桿菌菌種的同源性高達(dá)99%?？膳卸ù朔蛛x菌株為奇異變形桿菌。

3 討論

奇異變形桿菌廣泛分布于自然界可以通過消化道、呼吸道等途徑傳播，近年來不斷有豬群爆發(fā)流行奇異變形桿菌的報(bào)道，該病已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的一種新的細(xì)菌性傳染病。并且還可引起人類的原發(fā)性或繼發(fā)性感染，造成人類食物中毒，其作為人畜共患傳染病病原，應(yīng)引起高度重視。細(xì)菌培養(yǎng)是臨床鑒定細(xì)菌的傳統(tǒng)方法，而本試驗(yàn)應(yīng)用傳統(tǒng)方法和16SrDNA序列分析檢測(cè)奇異變形桿菌相結(jié)合的技術(shù)，更加快速、簡(jiǎn)便，為該病的診斷提供了有效的途徑。疫病的發(fā)生與機(jī)體的抵抗力密切相關(guān)，預(yù)防該病的關(guān)鍵是加強(qiáng)豬群的飼養(yǎng)管理，增強(qiáng)機(jī)體的防御能力。