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      奶牛三種早孕診斷方法的比較

      2012-10-26 07:08:58孫振師張化恒山東省萊西市畜牧獸醫(yī)局266600
      山東畜牧獸醫(yī) 2012年4期
      關(guān)鍵詞:尿樣靈敏性測定方法

      蘇 妮 孫振師 張化恒 (山東省萊西市畜牧獸醫(yī)局 266600)

      奶牛早期妊娠診斷是提高奶牛繁殖率和產(chǎn)奶量的重要措施,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。最早應(yīng)用的早孕診斷方法是直腸檢查法,但此法確診時(shí)間晚,勞動(dòng)強(qiáng)度大,診斷準(zhǔn)確率受技術(shù)水平和操作狀態(tài)的影響大,且診斷過程易對胚胎造成危害。所以自70年代開始,國內(nèi)外進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)室早孕診斷方法的研究,如放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫乳膠凝集抑制試驗(yàn)等,但這些診斷早孕的方法目前仍處于進(jìn)一步研究階段。為了探討適合廣大基層單位奶牛早孕診斷的方法,筆者對184頭配種后21~26d的奶牛分別用RIA.、ELISA、LAIT法進(jìn)行了早孕診斷的對比試驗(yàn)研究。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及采樣

      1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇發(fā)情配種后21~26d的黑白花奶牛184頭。

      1.1.2 奶樣采集 取每頭奶牛上午擠的混合奶為奶樣,其中一部分脫脂后作RIA法測定。

      1.1.3 脫激素乳的制備 取20ml乳樣加2.0g活性炭,磁力攪拌器攪拌30min,置冰箱內(nèi)過夜,2000r/min離心1h,取上清液同法每離心1次收集上清液即為去激素率98%的脫激素乳,用于ELISA法測定。

      1.1.4 尿樣采集 取非晨時(shí)自然排出的尿液,用作LAIT的測定尿樣。

      1.2 試劑與儀器

      1.2.1 RIA法的試劑與儀器 抗血清是以孕酮-11a-半琥珀酸鹽-RSA所免疫的家兔制備的,孕酮放射免疫藥盒由中國科學(xué)院動(dòng)物研究所提供。

      1.2.2 ELISA法試劑與儀器 抗血清同RIA法制備,辣根過氧化物酶(HRP.R2≈3.0),牛血清白蛋白,氯甲酸異丁酯,3,3′5,5′-四甲基苯胺(TMB),CP等。40孔ELISA微量測定板,S-ELISA-833型酶標(biāo)測定儀。酶結(jié)合物按Dawsow(1978)和Munro(1984)的混合酸酐法合成的孕酮-辣根過氧化物酶(P-11-HRP)。工作液按石放雄的方法制備。

      1.2.3 LAIT法的試劑與儀器 免疫乳膠凝集抑制妊娠診斷試劑為衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所提供。

      1.3 測定方法

      1.3.1 RIA法 以Heap(1976)奶中孕酮分析法和中國科學(xué)院動(dòng)物研究所的血漿孕酮分析法的操作程序進(jìn)行,孕酮標(biāo)準(zhǔn)曲線按Log-dose法在半對數(shù)紙上制作。測定范圍為0~800pg。

      1.3.2 ELISA法 按石放雄(1987)操作程序,首先制作0~1000pg的典型孕酮濃度-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線和孕酮濃度-結(jié)合率標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后同法進(jìn)行乳樣測定,在酶標(biāo)定量儀上讀取440um下的光密度。

      1.3.3 LAIT法 在清潔的載玻片上,加1滴待測尿樣,充分拌勻3min,在顯微鏡下(100×)觀察凝集抑制反應(yīng)。

      1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)及準(zhǔn)確率的檢測

      1.4.1 各測定方法的判定標(biāo)準(zhǔn) RIA與ELISA法的判定標(biāo)準(zhǔn)為21~26d奶中孕酮含量>4.0ng/ml為陽性(懷孕);奶中孕酮<2.0ng/ml為陰性(未孕);LIAT法判定標(biāo)準(zhǔn):若出現(xiàn)均勻一致的凝集顆粒為陰性(空孕);不出現(xiàn)凝集顆粒為陽性(孕牛)。

      1.4.2 各測定方法準(zhǔn)確率的檢測 根據(jù)對不同妊娠的直檢診斷結(jié)果和配種、產(chǎn)犢記錄資料進(jìn)行準(zhǔn)確率的檢測。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 不同早孕診斷方法的準(zhǔn)確率

      對配種后21~26d的184頭奶牛用RIA法診斷了51頭,用ELISA法診斷了55頭,用LAIT診斷了78頭,結(jié)果表明(表1):RIA法與ELISA法對奶牛早孕診斷的準(zhǔn)確率基本一致,而LAIT法早孕診斷的準(zhǔn)確率明顯高于RIA與ELISA法。

      表1 3種早孕診斷方法準(zhǔn)確率的比較

      2.2 3種早孕診斷方法應(yīng)用價(jià)值分析

      RIA與ELISA法其靈敏性基本一致 ,LAIT法靈敏性較高;RIA法每日可測150份奶樣,ELISA法每日可測200份奶樣,LAIT法每日可測400頭尿樣,所以LAIT法工作效率較高;RIA法與ELISA法操作復(fù)雜,所需試劑、儀器昂貴,而 LAIT法操作簡單,所用試劑、儀器簡單便宜。

      3 小結(jié)與討論

      (1)通過用RIA法、ELISA法和LAIT法分別對51頭、55頭、和78頭奶牛進(jìn)行的早孕診斷比較,診斷準(zhǔn)確率以LIAT法最高,達(dá)92.31%,比RIA法 與ELISA法分別提高8%和6.85%。(2)LIAT法和RIA法與ELISA法診斷的靈敏性高,操作簡單,容易掌握,工作效率高,且可現(xiàn)場測定,因此是基層生產(chǎn)單位值得大力推廣的奶牛早孕診斷方法。

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