抗條銹小麥－非洲黑麥漸滲系的分子細(xì)胞學(xué)鑒定

賈舉慶，郭紅媛，李倩冉，董娟，楊武德，楊足君

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801；2.電子科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都610054）

小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾霓r(nóng)作物，在我國也是僅次于水稻的主要糧食作物之一，但同其它大多數(shù)作物一樣，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)體系下，小麥的遺傳多樣性丟失極為嚴(yán)重，其對(duì)生物性和非生物性的環(huán)境協(xié)迫變得十分脆弱，限制了小麥產(chǎn)量的大幅度提高和品質(zhì)的進(jìn)一步改良。小麥族近緣植物中蘊(yùn)含著豐富的優(yōu)異基因，是小麥遺傳改良可利用的重要資源。目前通過染色體工程方法，已將多種小麥族近緣物種的優(yōu)異基因?qū)胄←溸z傳背景中，育成了一系列小麥外源染色體附加、代換和易位系等中間材料，在生產(chǎn)上得到廣泛的應(yīng)用［1］。

黑麥屬（Secale L.）作為小麥屬的近緣物種，以其優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，如高產(chǎn)、廣適及對(duì)病蟲害的抗性，成為小麥遺傳改良的優(yōu)異資源，也是小麥遠(yuǎn)緣雜交中利用最成功的遠(yuǎn)緣物種之一［2］。在系統(tǒng)分類學(xué)上黑麥屬分為栽培黑麥（S.cereale L.）和野生黑麥，其中以栽培黑麥在小麥改良中的應(yīng)用最為廣泛［3，4］。但近年來，由于栽培黑麥中的抗病基因?qū)π碌牟±硇》N失去抗性、1RS／1BL易位系高產(chǎn)特性已得到充分發(fā)揮、一些黑麥染色體上的劣質(zhì)基因被認(rèn)識(shí)、發(fā)現(xiàn)等現(xiàn)象的出現(xiàn)，導(dǎo)致各國對(duì)栽培黑麥的利用停滯不前［3～5］。目前被廣泛利用的小麥－黑麥易位系的供體黑麥材料，也主要局限在幾個(gè)如德 國 白 粒［6］、荊 州 黑 麥［7］、秦 嶺 黑 麥［8］、威 嶺 黑麥［9］等少數(shù)幾個(gè)黑麥品種之中。因此，充分發(fā)掘野生黑麥中的優(yōu)異基因，加強(qiáng)野生黑麥基因資源的利用，對(duì)小麥可持續(xù)性抗病遺傳育種具有重要的意義。

非洲黑麥（S.africanum Stapf）是黑麥屬的重要多年生野生物種，具有矮桿、異花授粉、抗多種小麥病害等優(yōu)異性狀，是小麥育種潛在的可利用資源。目前關(guān)于非洲黑麥的研究報(bào)道不多，主要集中在進(jìn)化方面，認(rèn)為非洲黑麥和森林黑麥（S.sil vestre）遺傳距離較近，與其他栽培黑麥距離較遠(yuǎn)；非洲黑麥中的異染色質(zhì)比栽培黑麥少［10］。在小麥育種利用方面，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)合成了小麥－非洲黑麥的雙二倍體材料，為非洲黑麥基因向小麥中導(dǎo)入提供了橋梁材料［11］。其他關(guān)于非洲黑麥的核型和帶型、小片段漸滲系的創(chuàng)制與利用還未開展。

本研究擬對(duì)非洲黑麥核型、帶型及非洲黑麥向小麥轉(zhuǎn)育過程形成一系列的漸滲系為材料進(jìn)行分子細(xì)胞學(xué)鑒定，并結(jié)合抗條銹病鑒定，篩選抗病優(yōu)異材料，為利用這一優(yōu)異基因資源提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

非洲黑麥由美國密蘇里植物園提供。安岳排燈麥－非洲黑麥雙二倍體（AF）和波斯小麥－非洲黑麥雙二倍體（BF）由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)蔣華仁研究員合成［12］。L系材料為小麥品種綿陽11與BF雜交的F6后代。安岳排燈麥、波斯小麥、Aurora（1RS／1BL品種）和中國春（CS）由電子科技大學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 C帶分析

C分帶參照任正?。?3］的操作流程，略加改動(dòng)。

1.2.2 SCAR標(biāo)記PCR擴(kuò)增

PCR所用引物為非洲黑麥基因組特異引物O5 （5＇－CCCAGTCACTACAACGAGAGT－3＇）；O5 R（5＇－GCTACAAGAGCTTCGTGCAG－3＇），25 μL反應(yīng)體系（包含50 ng基因組DNA，0.2μmol·L－1引物，200μmol·L－1d NTP，1×PCR buffer，2.0 mmol·L－1Mg Cl2和1 U Taq聚合酶）；擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠分離，紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

1.2.3 原位雜交分析

制片采用任正隆等［13］的方法，熒光原位雜交所用探針標(biāo)記按DIG－Nick試劑盒（Roche公司）的操作方法，原位雜交參照Mukai的方法［14］。

1.2.4 醇溶蛋白分析

醇溶蛋白分析采用A－PAGE的方法，具體參照 Yang等的方法［15］。

1.2.5 抗條銹病分析

苗期接種與抗性鑒定于2009～2011年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所溫室中進(jìn)行，所用條銹菌系為國內(nèi)目前流行小種CYR30和CYR31。條銹病接種采用苗期涂抹法，具體為：待感病品種SY95－71和供試小麥幼苗第一葉充分展開后，將混有滑石粉的銹菌夏孢子涂抹在已去蠟質(zhì)的小麥葉片上；成株期采用噴施法接種，即將新鮮孢子懸浮液噴施于葉片上，待SY95－71充分發(fā)病時(shí)調(diào)查成株的表現(xiàn)型。在本試驗(yàn)中，按0～4級(jí)常規(guī)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查逐株記載實(shí)驗(yàn)材料的反應(yīng)型即0、0；、1、2、3和4，其中0和0；為免疫和近免疫、1為高抗、2為中抗、3為中感、4為高感。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥－非洲黑麥雙二倍體細(xì)胞學(xué)鑒定

以地高辛標(biāo)記的非洲黑麥基因組DNA為探針，基因組原位雜交（GISH）發(fā)現(xiàn)，在BF雙二倍體材料中鑒定出14條非洲黑麥染色體（圖1 A），說明非洲黑麥染色體在雙二倍體中得到很好的保存。利用染色體C帶技術(shù)對(duì)同一個(gè)細(xì)胞中的染色體進(jìn)行C分帶，結(jié)合小麥ABD染色體的標(biāo)準(zhǔn)C帶型及非洲黑麥的GISH圖（圖1 A和B）、參照Lukaszewski等［16］劃分的栽培黑麥染色體標(biāo)準(zhǔn)C帶圖對(duì)這14條非洲黑麥染色體進(jìn)行更明確的劃分與標(biāo)記，做出了非洲黑麥標(biāo)準(zhǔn)C帶圖（圖1C）。通過將非洲黑麥與栽培黑麥的染色體C帶對(duì)照比較發(fā)現(xiàn)，其中非洲黑麥的1Ra、2Ra、3Ra、5Ra和6Ra染色體的C帶型與栽培黑麥的1R、2R、3R、5R和6R染色體的C帶型相似，但4Ra和7Ra在長度和端部異染色質(zhì)上都比栽培黑麥4R和7R染色體短和少。

2.2 雙二倍體中染色體的重組

利用從非洲黑麥中分離出來的重復(fù)序列p Sa O5411作探針對(duì)32株BF后代材料進(jìn)行熒光原位雜交（FISH）時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中有9株中存在小麥染色體和非洲黑麥染色體發(fā)生小片段易位（圖2 A）；利用非洲黑麥基因組DNA探針對(duì)16株AF后代材料進(jìn)行GISH時(shí)也發(fā)現(xiàn)了非洲黑麥染色體斷裂及與小麥染色體發(fā)生小片段易位現(xiàn)象，并且這些易位中除了端部易位外還發(fā)現(xiàn)插入易位，在16株AF后代中發(fā)現(xiàn)了3株有非羅伯遜易位現(xiàn)象（圖2B）。這些結(jié)果都說明在小麥－非洲黑麥雙二倍體中小麥染色體和非洲黑麥染色體發(fā)生了大量的重組，并且重組呈現(xiàn)出多類型現(xiàn)象。

圖1 非洲黑麥染色體鑒定及標(biāo)準(zhǔn)C帶圖的建立Fig.1 Identification of S.africaum chromoso mes and standard C band patter n

圖2 有絲分裂期BF染色體FISH（A）和AF染色體GISH圖（B）Fig.2 FISH（A）and GISH（B）pattern of AF mitotic metaphase chromosomes

2.3 抗條銹病漸滲系的篩選與鑒定

利用非洲黑麥基因組特異SCAR標(biāo)記O5F／R對(duì)BF與MY11小麥雜交F6后103株后代材料中，檢測(cè)出36株材料含有黑麥染色質(zhì)（圖3）。

圖3 部分雜交后代材料以SCAR標(biāo)記PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The PCR amplification results by SCAR mar ker in partial materials

對(duì)36株含非洲黑麥染色質(zhì)的材料及其親本小麥和非洲黑麥及小麥－非洲黑麥雙二倍體接條銹菌小種發(fā)現(xiàn)，在36株中有19株材料（L1－L19）對(duì)條銹菌表現(xiàn)出不同程度抗性（表1）。

綜合利用生化、細(xì)胞生物的方法對(duì)這19株材料進(jìn)行鑒定。利用順序基因組原位雜交和染色體C帶技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)，L3材料中黑麥染色體插入易位到小麥染色體中，至于插入片段具體來源，由于插入片段過小，通過C帶圖還無法確定（圖4 A和B）；通過1RaS／1BL易位染色體特征GISH圖，可以認(rèn)為L1為只攜帶一條1RaS／1BL易位染色體的易位系材料（圖4C和D）；結(jié)合C帶圖，可以認(rèn)為L16材料是小麥3BS染色體端部與非洲黑麥3Ra染色體發(fā)生了易位（圖4E和F）；利用GISH技術(shù)，認(rèn)為材料L17為1Ra代換系（圖4 G和H），至于代換了小麥哪條染色體，由于缺乏C帶證據(jù)還無法判斷；利用醇溶蛋白電泳（圖4I）（箭頭所示為黑麥堿特征條帶）和GISH技術(shù)（圖4J）分析認(rèn)為，L9－15共7個(gè)材料為攜帶了一對(duì)1RaS／1BL易位染色體的易位系材料。其他其他攜帶非洲黑麥染色質(zhì)的抗條銹病材料利用GISH沒有檢測(cè)到雜交信號(hào)。

表1 試驗(yàn)材料的條銹病的侵染型及染色體組成Table 1 Rust response to P.striifor mis f.sp.tritici and genomic structures of parents，amphiploids，stripe rust resistant derivatives and controls

圖4 部分L系材料的C帶、GISH和A－PAGE圖Fig.4 C－banding（A）and GISH（B）patter n and A－PAGE patter n of a part of L lines

3 結(jié)論與討論

3.1 非洲黑麥染色體標(biāo)準(zhǔn)C帶型的建立

染色體帶型分析是辨別染色體的一種簡單快速的方法［17］。在小麥族物種的研究中應(yīng)用最廣的是C帶技術(shù)，但在小麥族植物遠(yuǎn)緣雜交中如要鑒定外緣染色體必需要有染色體的標(biāo)準(zhǔn)帶型加以對(duì)照識(shí)別，因此Gill等用普通小麥中國春為材料，做出了小麥分帶核型［18］；Lukaszewski等建立了黑麥染色體C－帶標(biāo)準(zhǔn)帶型［16］。但研究認(rèn)為非洲黑麥的異染色質(zhì)跟栽培黑麥有一定的差別，這也在本研究中得以證實(shí)，如4Ra和7Ra在長度和端部異染色質(zhì)上都比栽培黑麥4R和7R染色體短和少（圖1）。本研究通過參考栽培黑麥染色體C帶帶型，建立非洲黑麥的標(biāo)準(zhǔn)C帶，為今后小麥背景中快速識(shí)別非洲黑麥染色體提供依據(jù)。

3.2 雙二倍體中染色體重組

遠(yuǎn)緣雜交過程中，由于染色體的不親和往往導(dǎo)致出現(xiàn)減數(shù)分裂不穩(wěn)定現(xiàn)象，并且容易形成非整倍體［10］，這在本試驗(yàn)中也有所體現(xiàn)，在對(duì)BF后代材料中的細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，染色體數(shù)目存在40至42條不等現(xiàn)象（數(shù)據(jù)未列出），這種不穩(wěn)定性恰恰為育種提供了豐富的變異類型以供選擇。此外，在本試驗(yàn)中，不管是AF還是BF中都發(fā)現(xiàn)了多種類型的染色體易位現(xiàn)象，包括小麥染色體端部與非洲黑麥染色體整條染色體或染色體片段融合、染色體的非羅伯遜易位甚至有非洲黑麥染色體片段插入到小麥染色體中的現(xiàn)象（圖2）。而這種頻繁且多類型的重組現(xiàn)象在栽培黑麥形成的八倍體或六倍體小黑麥中很少出現(xiàn)，如并沒發(fā)現(xiàn)有栽培黑麥染色體插入易位到小麥染色體中的現(xiàn)象［19］。非洲黑麥與小麥染色體這種頻繁的重組可能是非洲黑麥異染色質(zhì)少有關(guān)。Yang等用從栽培黑麥中分離到的串聯(lián)重復(fù)序列彌散狀分布于栽培黑麥所有染色體上，但用該序列雜交非洲黑麥時(shí)發(fā)現(xiàn)，這種重復(fù)序列除了雜交非洲黑麥的6Ra染色體外，其他染色體上都沒有分布［19］，而研究認(rèn)為，重復(fù)序列及異染色質(zhì)化在植物性染色體重組中會(huì)起到抑制作用［20］。

3.3 小麥－非洲黑麥漸滲系中小片段易位現(xiàn)象

遠(yuǎn)緣雜交遺傳改良小麥的過程中往往會(huì)產(chǎn)生染色體附加、染色體代換和染色體易位等現(xiàn)象。在本研究中，無論是AF還是BF在于MY11小麥雜交F6后代材料中我們都是發(fā)現(xiàn)了染色體的代換和易位（圖4），但還沒發(fā)現(xiàn)染色體的附加現(xiàn)象，并且代換也只是發(fā)現(xiàn)一對(duì)1Ra代換系材料（L17）（圖4G和H），這可能與試驗(yàn)材料的數(shù)量不足有關(guān)。在染色體發(fā)生易位的材料中，出現(xiàn)了各種易位類型，如一對(duì)1RaS／1BL易位系材料（L9－15）（圖4I和J）；一條3Ra染色體在端部與半條小麥染色體發(fā)生易位的L16材料（圖4E和F）；L1和L3中的小片段易位（圖4 A、B、C和D）等。有趣的是，本試驗(yàn)中L2－10、L18和L19等11株材料中的黑麥染色質(zhì)只能通過分子標(biāo)記檢測(cè)（圖3），而無法利用GISH技術(shù)檢測(cè)（檢測(cè)無雜交信號(hào)，結(jié)果沒列出），這可能因?yàn)闈B入到小麥中的非洲黑麥染色體易位片段過小，超出了GISH技術(shù)所能檢測(cè)的最小片段范圍［14］。對(duì)于這些小片段易位材料的鑒定則需要在今后試驗(yàn)中開發(fā)非洲黑麥的單染色體標(biāo)記來加以檢測(cè)。雖然這些小片段易位系難以檢測(cè)，單這些小片段易位材料能很好的克服大片段易位所帶來的外源不利基因，如黑麥堿（Sec1），對(duì)小麥品質(zhì)的影響［21］，并且小片段易位對(duì)后代材料染色體的正常配對(duì)與穩(wěn)定遺傳都有積極作用。因此這些材料更是今后育種中要重點(diǎn)利用的對(duì)象。

3.4 非洲黑麥中的抗條銹基因

黑麥中攜帶許多優(yōu)異的抗性基因，特別是1RS染色體攜帶的抗條銹病基因Yr 9得到廣泛的利用，在小麥遺傳育種上產(chǎn)生了重要的影響［21］。研究發(fā)現(xiàn)不同黑麥屬種同一染色體上攜帶的抗性基因也有所不同，如來源于Insave黑麥中的Pm17與Pet kus黑麥抗白粉病基因Pm8，雖然二者都是位于黑麥1RS染色體上，但其對(duì)白粉病的抗譜并不相同；同樣來源于Petkus黑麥1RS染色體上的Sr 31與Imperial黑麥1RS染色體上Sr R也不盡相同；來源于不同黑麥后代L155和R12中也存在兩種不同類型的1RS／1BL易位系，那些對(duì)Yr 9有毒性的條銹病生理小種在這兩種黑麥及其后代材料上表現(xiàn)出不同的侵染類型［22］。本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)1 RS／1BL易位系材料Aur ora在對(duì)條銹病失去抗性時(shí)，L9－15和L17這些攜帶1RS染色體的材料卻對(duì)條銹病表現(xiàn)出良好的抗性（表1）。因此，在傳統(tǒng)抗條銹基因的抗病性逐漸喪失的同時(shí)，非洲黑麥1 RS染色體上仍存在優(yōu)異的抗條銹新基因。此外，在本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)非洲黑麥其他染色體中也攜帶有優(yōu)良的抗條銹基因（L16為3 Ra染色體與小麥染色體易位），這都說明非洲黑麥中攜帶多種抗條銹病基因，因此可以成為小麥抗條銹遺傳育種的寶貴資源。

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