丙酸桿菌素高產(chǎn)菌株的誘變選育

劉 靖，王立梅，齊 斌，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品工程學院，吉林長春130118；2.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500；3.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟 215500）

丙酸桿菌素高產(chǎn)菌株的誘變選育

劉 靖1，王立梅2，3，齊 斌2，3，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品工程學院，吉林長春130118；2.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500；3.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟 215500）

丙酸桿菌素是乳品丙酸桿菌代謝合成的一種重要的多肽或蛋白質(zhì)，能抑制革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽性菌、霉菌和酵母菌的生長。以丙酸桿菌Propionibacterium feudenreichii CS01為出發(fā)菌株，采用紫外（UV）和亞硝基胍（NTG）復合誘變的方法，獲得高產(chǎn)突變株N11和N42，其抑菌活性達到28.63、28.83AU/mL，分別比原始出發(fā)菌株（21.14AU/mL）提高了35.4%和36.4%。

丙酸桿菌素，紫外，亞硝基胍，誘變

乳品丙酸桿菌可以代謝合成一種重要的多肽或蛋白質(zhì)，稱之為丙酸桿菌細菌素，它能抑制乳品中革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽性菌、霉菌和酵母的生長，從而防止乳制品變質(zhì)[1]。丙酸桿菌素在食品防腐劑方面具有很大潛力，已經(jīng)引起廣泛的關注[2-4]，許多國外學者相繼對其進行研究，我國在這方面的研究還處于起步的階段[5-7]。由于丙酸桿菌素存在產(chǎn)量低、成本高、效價低、用量大、抗菌時效短等問題，因此需要對菌種進行改良以提高其經(jīng)濟效益。本文以費氏丙酸桿菌謝氏亞種Propionibacterium feudenreichii CS01為出發(fā)菌株，進行紫外和亞硝基胍復合誘變，探索誘變條件，并得到兩株穩(wěn)定高產(chǎn)的突變株N11和N42。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

丙酸桿菌Propionibacterium.feudenreichii CS01，金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）ATCC25923；液體培養(yǎng)基（g/L） 乳酸鈉20，酵母膏10，KH2PO41，MgSO40.2，Tween80 1，pH 7.0；固體培養(yǎng)基（g/L） 乳酸鈉20，酵母膏10，KH2PO41，MgSO40.2，Tween80 1，瓊脂20，pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖20，酵母膏10，KH2PO41，MgSO40.2，Tween80 1，pH 7.0；指示菌培養(yǎng)基（g/L） 牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.0；亞硝基胍（NTG） 在通風櫥中稱取1g亞硝基胍加入10m L丙酮作為助溶劑，完全溶解后取1m L亞硝基胍丙酮溶液加入9m L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.02mol/L）配制成NTG濃度為10mg/m L的亞硝基胍母液，保存于棕色瓶中[8]；生理鹽水（0.85%） NaCl 8.5g，蒸餾水1000m L，于115℃滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 用接種環(huán)將平板上活化好的菌株挑取一環(huán)單菌落接種到10m L液體培養(yǎng)基中，30℃厭氧培養(yǎng)2.5d，按照2%的接種量接種到裝有30m L液體培養(yǎng)基的100m L三角瓶中，30℃厭氧培養(yǎng)2.5d。將培養(yǎng)液于8000r/min離心10min并用生理鹽水洗滌兩次，加入0.05mol/L Tris-HCl（pH 7.1）中，調(diào)整菌體濃度為108cfu/m L。

1.2.2 紫外（UV）誘變[8]

1.2.2.1 紫外（UV）誘變劑量的確定 將紫外燈打開預熱20～30min，取10m L菌懸液于直徑為9cm的無菌培養(yǎng)皿，液層厚度約2mm，放于磁力攪拌器上攪拌，使用254nm的紫外燈管，照射距離為20cm，照射時間分別為1、2、3、4、5m in，各取1m L菌液在紅光下進行倍數(shù)稀釋后涂布于固體平板上，30℃避光厭氧培養(yǎng)3d，采用平板菌落計數(shù)法計算致死率。

1.2.2.2 紫外與光復活交替處理誘變 將紫外燈打開預熱20～30m in，取10m L菌懸液置于直徑為9cm的無菌培養(yǎng)皿，液層厚度約2mm，放于磁力攪拌器上攪拌，使用254nm的紫外燈管，照射距離為20cm，照射時間為實驗得到的最佳誘變劑量，再將UV照射后的菌懸液置于日光燈下10min，反復操作三遍后進行倍數(shù)稀釋后涂布于固體平板上，30℃避光厭氧培養(yǎng)3d，采用平板菌落計數(shù)法計算致死率。

1.2.3 亞硝基胍（NTG）誘變 取6等份菌懸液，加入一定比例的NTG母液，使菌懸液亞硝基胍終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L，30℃振蕩30m in，加入1000倍4℃無菌生理鹽水稀釋，終止誘變[9-10]?；旌暇鶆蚝筮M行倍數(shù)稀釋，涂布于固體培養(yǎng)基平板上，30℃厭氧培養(yǎng)3d，采用平板菌落計數(shù)法計算致死率。

1.2.4 紫外（UV）和亞硝基胍（NTG）復合誘變處理

按照上述誘變方法，進行3輪紫外（UV）光復活交替誘變，篩選出高產(chǎn)菌株并以其做為出發(fā)菌株進行3輪亞硝基胍（NTG）誘變。

1.2.5 正向突變株的遺傳穩(wěn)定性實驗 采用連續(xù)傳代的方法檢驗正突變株高產(chǎn)丙酸桿菌素的穩(wěn)定性。將誘變后長出的菌落進行反復篩選發(fā)酵，測定丙酸桿菌素的抑菌活性。將抑菌活性高的菌株連續(xù)傳代5次。

1.2.6 突變株發(fā)酵生產(chǎn)丙酸桿菌素 挑取一環(huán)誘變獲得的菌株，接種于5m L液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2.5d后，接種于50m L發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)9d。將發(fā)酵液在4℃，2500r/m in的條件下離心10m in，取上清液并邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末，至硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為70%，繼續(xù)攪拌均勻，放于4℃冰箱中沉淀過夜。4℃，8000r/m in的條件下離心20m in，棄上清液并將沉淀物加無菌水溶解后，4℃透析48h，每隔4h換水1次，再將透析液冷凍干燥，向凍干物中加入100m L蒸餾水，充分溶解，制成丙酸桿菌素溶液。

1.2.7 丙酸桿菌素抑菌活性（AU）的測定[11-14]采用96微孔板分光光度計（酶標儀）快速測定丙酸桿菌素的抑菌活性（AU）。

1.2.7.1 丙酸桿菌素的稀釋 取2m L無菌離心管若干，采用2倍梯度稀釋法，向各心管中加入750μL的發(fā)酵培養(yǎng)基，用移液槍移取750μL的丙酸桿菌素于第一個離心管中，充分混合均勻后移取750μL于第二個離心管中，依次類推至稀釋度為2-7。

1.2.7.2 酶標板的制備與測定[15]向酶標板每孔中加入100μL指示菌液，再向各孔分別加入100μL不同稀釋濃度的丙酸桿菌素，并以100μL發(fā)酵培養(yǎng)基做空白對照。37℃恒溫培養(yǎng)12h，用酶標儀測定其OD600nm值。每稀釋度做三組平行實驗。

1.2.7.3 丙酸桿菌素抑菌活力的計算 將實驗組的OD值與對照值進行比較，當實驗值為對照值的一半時，將丙酸桿菌素的稀釋度記為一個抑菌活性單位（AU）。

2 結果與分析

2.1 紫外（UV）誘變劑量

圖1 紫外誘變時間對細胞致死率的影響Fig.1 Effect of UVmutagenesis time on themortality rate

采用紫外線照射對出發(fā)菌進行不同時間的誘變，照射時間與細胞致死率的關系如圖1。由圖可知，隨著照射時間的延長，致死率逐漸提高，照射3、4、5m in致死率分別為82.51%、90.84%、94.62%。研究表明[16-17]，致死率在80%～90%時正突變株較多，致死率在90%～99.9%時負突變株較多[17]，故確定最佳紫外（UV）誘變劑量為照射3min。

2.2 亞硝基胍（NTG）誘變劑量

圖2 亞硝基胍濃度對細胞致死率的影響Fig.2 Effect of the NTG contenton themortality rate

采用不同濃度的NTG溶液進行誘變，NTG濃度與細胞致死率的關系如圖2。由圖可知，隨著NTG濃度的增加，致死率逐漸提高，濃度為0.8g/L和1.0g/L時致死率分別為86.52%和93.46%。致死率在80%～90%時誘變效果為最佳，故確定亞硝基胍（NTG）的誘變劑量為0.8g/L。

2.3 復合誘變[18]

以丙酸桿菌（Propionibacterium.feudenreichii CS01）為出發(fā)菌株，采用上述最佳誘變劑量，經(jīng)3輪紫外誘變與光復活交替處理，通過酶標儀檢測得到9株丙酸桿菌素產(chǎn)量較高的誘變株，編號為U1～U9。原始菌株Y與誘變菌株生產(chǎn)的丙酸桿菌素的抑菌活性見圖3。由圖3可知原始菌株經(jīng)紫外誘變后抑菌活性除菌株U2都有明顯提高，其中菌株U5和U9抑菌活性最高，達到26.72AU/m L和27.19AU/m L，分別比原始菌株提高了26.4%和28.6%。

圖3 紫外誘變復篩結果Fig.3 The selection ofhigh-bacteriostasisactivitymutantsby UV

以U5和U9為出發(fā)菌株進行亞硝基胍（NTG）誘變，獲得15株丙酸桿菌素抑菌活性較高的突變株，見圖4。由圖4可知菌株U5和U9經(jīng)亞硝基胍誘變后抑菌活性進一步提高，其中菌株N11、N19和N42抑菌活性最高，達到28.63、28.69、28.83AU/m L，分別比原始菌株提高了35.4%、35.7%和36.4%。

圖4 亞硝基胍誘變復篩結果Fig.4 Theselectionofhigh-bacteriostasisactivitymutantsbyNTG

2.4 遺傳穩(wěn)定性

經(jīng)紫外誘變和亞硝基胍誘變篩選獲得5株抑菌活性較高的正向突變株，分別為U5、U9和N11、N19、N42。將這5株菌連續(xù)傳代5次，檢測每代菌株所產(chǎn)丙酸桿菌素的抑菌活力見表1。由表1可以看出，經(jīng)過傳代5次后菌株U5和N11、N42各代所產(chǎn)丙酸桿菌素的抑菌活性變化不大，遺傳穩(wěn)定性良好，菌株U9和N19產(chǎn)生了回復突變。這可能是由于菌株不適應生長條件而影響目標代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，或者外界環(huán)境因素引起基因發(fā)生自發(fā)突變，導致菌種發(fā)生退化[19]。

表1 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗結果Table1 Theexperimental resultsofgenetic stabilityof themutants

3 結論

本文研究了紫外線與亞硝基胍復合處理對丙酸桿菌產(chǎn)丙酸桿菌素抑菌活性的影響，確定復合誘變的條件：紫外（UV）誘變劑量為照射3min，亞硝基胍（NTG）的誘變劑量為0.8g/L。進行3輪紫外（UV）光復活交替誘變和3輪亞硝基胍（NTG）誘變后，得到兩株高產(chǎn)菌株N11、N42，抑菌活性達到了28.63、28.83AU/m L，分別比原始出發(fā)菌株提高了35.4%和36.4%。將5株誘變菌株U5、U9、N11、N19、N42傳代5次，其中N11和N42抑菌活性較高且變化不大，說明突變株不易發(fā)生退變，遺傳性穩(wěn)定。

[1]Grinstead D A，Barefoot S F，Jenseniin G.A heatsrable bacteriocin produced by propionibacterium jendennii P127[J]. Applied and EnvironmentalMicrobiology，1992，58：215-220.

[2]Mori H，Sato Y，Taketomo T，et al.Isolation and structural identffication of bifidogenic growth stimulator produced by Propionibactefium freudenreichii[J].Dairy Science，1997，80：1959-1964.

[3]李平蘭，江漢湖.細菌素研究概述[J].中國畜產(chǎn)與食品，1998，5（2）：82-84.

[4]賴毅東，寧正祥.生物防腐劑—細菌素[J].廣東食品工業(yè)科技，1999，18（4）：54-56.

[5]儀宏，王麗麗，馮惠勇，等.丙酸積累對薛氏丙酸桿菌生長及產(chǎn)酸的影響[J].微生物學通報，2003，30（3）：29-30.

[6]王海晶，王玉華，齊斌.響應面法優(yōu)化產(chǎn)丙酸桿菌素菌株的培養(yǎng)條件[J].中國乳品工業(yè)，2011，39（2）：13-16.

[7]馬悅培，高紅亮，常忠義，等.不同初始pH對丙酸桿菌細菌素發(fā)酵的影響[J].食品工業(yè)科技，2010，31（5）：215-217.

[8]吳慧玲，李召虎.物理化學誘變選育冠菌素高產(chǎn)菌株[J].科技導報，2009，27（12）：34-37.

[9]蘇暢，陳洪，潘仙華.復合誘變選育γ-葵內(nèi)酯高產(chǎn)菌的研究[J].食品科技，2010，35（10）：20-23.

[10]諸葛健，沈微.工業(yè)微生物實驗與研究技術[M].北京：科學出版社，2007：219.

[11]Helge H，Therese F，Dag A B，etal.Bacteriocins of propionic acid bacteria[J].EPD Science，2002（10）：59-68.

[12]Holo H，Nilssen O，Nes I F.Lactococcin A，a new bacteriocin from lactococcus lactis subsp.cremoris：isolation and characterization of the protein and its gene[J].Journal of Bacteriology，1991，173：3879-3887.

[13]Kohji O，Yuhsuke W，Tetsuo U，et al.Catalyst development formethanol synthesisusing parallel reactors for high-throughput screening based on a 96 wellmicroplate system[J].Journal of the Japan Petroleum Institute，2003，46（5）：328-334.

[14]榮紹豐，常忠義，高洪亮，等.不同丙酸桿菌代謝物對酵母菌抑菌作用的研究[J].食品工業(yè)，2009（1）：1-4.

[15]陳默，王志偉，胡長鷹，等.酶標儀法快速評價香蘭素的抑菌活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（5）：63-66.

[16]LiY，F(xiàn)rank P，BentleyW E.Conditionedmedium from listeria innocua stimulates emergence from a resting state：nota response to E.Coli quorum sensing autoinducer AI-2[J].Biotechnol Prog，2006，22：387-393.

[17]蔣昵真，呂煒鋒，高向東，等.用紫外誘變和離子束注入篩選輔酶Q10高產(chǎn)菌[J].藥物生物技術，2006，13（3）：207-210.

[18]朱永強，方尚玲，覃敬羽，等.短梗霉多糖菌的復合誘變篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵科技，2010，46（1）：47-50.

[19]張克旭，陳寧，張蓓，等.代謝控制發(fā)酵[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2004：56-57.

Mutation breeding of a high propionicin producing strain

LIU Jing1，WANG Li-mei2，3，QIBin2，3，*

（1.School of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.School of Biotechnology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China；3.The Key Laboratory of Food and Biotechnology，Changshu 215500，China）

Propionicin is a kind of polypep tides or p roteins p roduced by dairy p ropionibacteria.They can restrain G-bacteria，some G+，fungiand yeast.Propionibacterium feudenreichii CS01 strain was used as original strain. Two mutants N11 and N42 were ob tained after being treated w ith ultraviolet（UV）and nitrosoguanid ine（NTG）. The antim ic robialactivity of N11 and N42 high amount strains were 28.63AU/m L and 28.83AU/m L respectively，35.4%and 36.4%more than the originalstrain（21.14AU/m L）.

p rop ionicin；UV；NTG；mutagenesis

TS252.1

A

1002-0306（2012）09-0187-03

2011－07－14 *通訊聯(lián)系人

劉靖（1983－），女，研究生，研究方向：食品生物技術。

江蘇省“六大人才高峰”項目。