首烏藤總黃酮的抑菌活性研究

楊 聞，段玉峰，王蓓蓓，羅喻紅，鄒柯婷，杜曉旭，史俊燕

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

首烏藤總黃酮的抑菌活性研究

楊 聞，段玉峰*，王蓓蓓，羅喻紅，鄒柯婷，杜曉旭，史俊燕

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

研究首烏藤總黃酮的體外抑菌效果，為首烏藤的進(jìn)一步廣泛開發(fā)利用提供理論依據(jù)。用打孔法測(cè)定首烏藤總黃酮的抑菌作用，酸堿和紫外光處理對(duì)首烏藤總黃酮抑菌活性的影響。結(jié)果表明，首烏藤總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒桿菌、李斯特桿菌的最小抑菌濃度（MIC）分別為6.25%、12.5%、12.5%、3.125%；對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌作用較不明顯。pH和紫外光對(duì)首烏藤總黃酮的抑菌性均有一定程度的影響。

首烏藤，總黃酮，抑菌活性

首烏藤，為衛(wèi)生部公布的藥食同源中藥品種之一，是寥科植物何首烏的藤莖或帶葉藤莖，又名夜交藤，最早記載于《日華子諸家本草》或《開寶本草》，而后《證類本草》、《滇南本草》、《本草綱目》等均有記載，李時(shí)珍在《本草綱目》中描述，其味甘性平，歸心、肝經(jīng)，具有養(yǎng)心安神、通絡(luò)祛風(fēng)之功效[1]。而藥食同源中藥中普遍含有黃酮類化合物，具有抗癌、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒以及抗氧化、抗衰老等作用[2]。宋毅等研究了首烏藤黃酮提取物體內(nèi)和體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，證明首烏藤黃酮提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌等都有抑制作用，對(duì)慢性炎癥有抗炎作用，對(duì)急性炎癥的抗炎作用不明顯[3]，但是沒(méi)有給出首烏藤黃酮提取物的最小抑菌濃度。目前對(duì)首烏藤化學(xué)成分方面研究較少且僅限于對(duì)其中蒽醌類包括大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的研究，國(guó)內(nèi)外對(duì)于首烏藤黃酮類化合物的抑菌作用報(bào)道較少且不系統(tǒng)。因此，本研究以市售經(jīng)鑒定的首烏藤為原料，對(duì)其總黃酮的抑菌活性進(jìn)行了研究，為有效地開發(fā)利用首烏藤提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

首烏藤 陜西省藥材公司提供，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、腸炎沙門氏菌（Bacillus enteritidis）、鼠傷寒桿菌（Baciltyphimurium）、李斯特桿菌（Listeria） 均由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；培養(yǎng)基 牛肉膏3g，蛋白胨10g，瓊脂粉15g，水1000m L，pH為7.1～7.3，完全溶解后裝入三角瓶中，加塞并在棉塞外包一層報(bào)紙并用麻繩捆扎，放入殺菌鍋內(nèi)121℃滅菌20m in[4]；石油醚，無(wú)水乙醇，無(wú)菌生理鹽水，0.1mol/L的Na2CO3溶液，生理鹽水等。

GSP-9080MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F凈化工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 首烏藤總黃酮的制備 稱取干燥粉碎的首烏藤3kg，過(guò)40目篩，先用石油醚脫脂12h，揮干石油醚，得到脫脂的首烏藤干粉，然后以料液比1∶15（g/m L），50%乙醇作為溶劑，進(jìn)行超聲輔助提取，提取溫度60℃，超聲時(shí)間40m in，超聲功率200W，提取兩次[5]。提取液過(guò)濾后減壓濃縮并冷凍干燥，得到干的首烏藤總黃酮提取物。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備[6]無(wú)菌條件下將適量培養(yǎng)基置于已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)至凝固，每個(gè)皿的量相等。

1.2.3 菌種活化 無(wú)菌條件下，將供試菌種接種于相應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，0～4℃冷藏室冷卻備用。

1.2.4 菌懸液的配制 預(yù)先把各種供試菌種用適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行菌種斜面活化，在無(wú)菌條件下用無(wú)菌生理鹽水沖洗斜面培養(yǎng)基直至將供試菌種全部沖洗至離心管中，3000r/m in離心5min，棄去上層清液，底部沉淀的細(xì)菌用一定量的無(wú)菌生理鹽水移至三角瓶中，振蕩搖勻制成菌懸液。將菌懸液稀釋成若干梯度，選取濃度較小的梯度用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡檢計(jì)數(shù)，計(jì)算出菌懸液的濃度，選取106～107個(gè)/m L濃度備用。

1.2.5 打孔法測(cè)定首烏藤總黃酮的抑菌作用[7-8]分別取各種供試菌懸液0.1m L于相應(yīng)的平皿上，用L棒將菌懸液涂布均勻，用滅過(guò)菌的打孔器在培養(yǎng)皿中間部位打孔，無(wú)菌條件下，每個(gè)孔注入0.1m L首烏藤總黃酮溶液，以注入無(wú)菌水為對(duì)照，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

1.2.6 首烏藤總黃酮的最小抑菌濃度（MIC）[9]采用二倍稀釋法，將首烏藤總黃酮溶液用無(wú)菌水稀釋為原溶液的50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.563%六個(gè)濃度，在無(wú)菌平皿中分別加入1m L不同濃度的稀釋液，然后倒入15m L培養(yǎng)基充分混合均勻，冷卻凝固后取0.1m L供試菌懸液于平板上涂布均勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察，每組重復(fù)三次，取平均值。

1.2.7 酸堿性對(duì)首烏藤總黃酮抑菌活性的影響[7]用0.1mol/L的Na2CO3和HCl將各種供試菌最低抑菌濃度下的首烏藤總黃酮溶液調(diào)節(jié)pH分別為4、5、6、7、8、9的一系列溶液，在無(wú)菌平皿中分別加入1m L不同pH的首烏藤總黃酮稀釋液，倒入15m L培養(yǎng)基混合均勻，冷卻凝固后取0.1m L相對(duì)應(yīng)的供試菌懸液于平板上涂布均勻，置于37℃下培養(yǎng)24h后觀察，每種細(xì)菌每個(gè)pH梯度平行做三組。

1.2.8 紫外光處理對(duì)首烏藤總黃酮抑菌活性的影響[7]將各種供試菌最低抑菌濃度下首烏藤總黃酮溶液置于紫外燈下30cm左右處分別照射10、20、30、40、50、60、70m in后，在對(duì)應(yīng)的無(wú)菌平皿中分別加入1m L處理過(guò)的首烏藤總黃酮稀釋液，倒入15m L培養(yǎng)基混合均勻，冷卻凝固后取0.1m L相對(duì)應(yīng)的供試菌懸液于平板上涂布均勻，置于37℃下培養(yǎng)24h后觀察，每種細(xì)菌每個(gè)處理時(shí)間梯度平行做三組。

2結(jié)果與分析

2.1 首烏藤總黃酮的抑菌效果

由表1可知，首烏藤總黃酮溶液對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒桿菌、李斯特桿菌的抑菌作用比較明顯，而對(duì)于枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌作用不明顯。

表1 首烏藤總黃酮的平均抑菌圈直徑（mm）Table 1 Antimicrobial circle diameter of total flavonoids from Caulis PolygoniMultifori（mm）

由表2可知，首烏藤總黃酮溶液對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒桿菌、李斯特桿菌的最小抑菌濃度分別為6.25%、12.5%、12.5%、3.125%，尤其是對(duì)李斯特桿菌具有明顯的抑制效果。

表2 首烏藤總黃酮的MICTable 2 MIC of total flavonoids from Caulis PolygoniMultifori

2.2 pH處理對(duì)首烏藤總黃酮抑菌活性的影響

由表3可知，首烏藤總黃酮溶液在不同pH條件下，對(duì)這四種菌的抑菌效果是有差異的，但是總體看來(lái)pH為5～6時(shí)溶液的抑菌效果最好，在pH保持為7時(shí)，對(duì)李斯特桿菌仍有良好的抑菌效果。

表3 pH對(duì)首烏藤總黃酮抑菌活性的影響Table 3 The antimicrobial effects of total flavonoids from Caulis PolygoniMultifori with different pH

2.3 紫外光線對(duì)首烏藤總黃酮抑菌活性的影響

由表4可知，20m in以內(nèi)的紫外光線照射對(duì)首烏藤總黃酮的抑菌活性不會(huì)產(chǎn)生明顯的影響，超過(guò)20m in其抑菌能力會(huì)出現(xiàn)不同程度的減弱。紫外光照射對(duì)金黃色葡萄球菌和鼠傷寒桿菌的影響最大，李斯特桿菌的敏感度最低。

表4 紫外光照射對(duì)首烏藤總黃酮抑菌活性的影響Table 4 Effectof ultraviolet radiation on antibiotic activity of total flavonoids from Caulis PolygoniMultifori

3 結(jié)論

用打孔法對(duì)首烏藤總黃酮的抑菌性測(cè)定可以看出，首烏藤總黃酮對(duì)一部分細(xì)菌具有較明顯的抑制作用，尤其對(duì)李斯特桿菌、鼠傷寒桿菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用較為明顯。首烏藤總黃酮抑菌成分在弱酸性條件下比較穩(wěn)定，最佳抑菌pH范圍是5～6；首烏藤總黃酮在紫外光線照射下20m in以內(nèi)，抑菌成分比較穩(wěn)定，超過(guò)20m in，抑菌成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變化，抑菌能力降低。

實(shí)驗(yàn)證明，首烏藤黃酮可作為一種理想的抑菌添加劑，預(yù)防和抵抗對(duì)李斯特桿菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒桿菌和金黃色葡萄菌所引起的感染，這為找到天然抑菌有機(jī)化合物提供了理論依據(jù)。

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Study on bacteriostasis activity of total flavonoids from Caulis PolygoniMultifori

YANG W en，DUAN Yu-feng*，WANG Bei-bei，LUO Yu-hong，ZOU Ke-ting，DU Xiao-xu，SHI Jun-yan
（College of Food Engineering and Nutritional Science，ShaanxiNormal University，Xi’an 710062，China）

The bacteriostasis effects of total flavonoids from Caulis Polygoni Multifori were stud ied，which p rovided a theoretical basis for further extensive research on Caulis PolygoniMultifori.The punch method was used to determ ine the bacteriostasis effects of total flavonoids from Caulis PolygoniMultifori.The effects of pH and UV treatment on the bacteriostasis activity of total flavonoids from Caulis PolygoniMultifori were evaluated. The results showed thatm inimum inhibitory concentration（MIC）values were Staphylococcus aureus 6.25%，Salmonella enieritid is 12.5%，Salmonella typhimurium 12.5%，Listeria spp 3.125%.The results were not obvious for Bacillus subtilis，Bacillus ceereus and Escherichia coli.There were some influence from pH and ultraviolet rad iation for bac teriostasis effects.

Caulis PolygoniMultiflori；total flavonoids；bacteriostasis activity

TS201.2

A

1002-0306（2012）09-0111-03

2011－07－18 *通訊聯(lián)系人

楊聞（1986-），男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2006B18）。