香蔥中蒜氨酸酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)

付一帆，周 宇，李星鑫，劉 瑩，王魯峰，潘思軼*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

香蔥中蒜氨酸酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)

付一帆，周 宇，李星鑫，劉 瑩，王魯峰，潘思軼*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

對香蔥中蒜氨酸酶進行分離純化并研究其酶學(xué)性質(zhì)。通過均漿、離心、硫酸銨分級沉淀、透析、DEAE-52離子交換層析和Sephadex G200凝膠過濾層析技術(shù)分離純化得到純度較高的蒜氨酸酶，并利用SDS-PAGE電泳對其純度進行鑒定。結(jié)果表明，經(jīng)分離純化可得純化倍數(shù)為19.6倍的蒜氨酸酶，酶比活力為11.44U/mg，酶活回收率為32.1%，達到電泳純，其亞基的分子質(zhì)量約為54.5ku。純酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，最適pH7.0，以S-甲基-L-半胱氨酸亞砜為底物，蒜氨酸酶的Km為45.31mmol/L，Vmax為40.32μmol/(mg·min)。

香蔥；蒜氨酸酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

香蔥(Allium schoenoprasumL.)又稱細香蔥、北蔥等，屬于百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)植物[1-2]，其味辛、性溫，有發(fā)汗解毒，通陽利尿、明目補中、調(diào)和脾胃及行乳安胎等諸多功效，并具有獨特、飄逸的濃郁香辛氣味，目前已成為人們必需的調(diào)味、保健蔬菜[3-7]，其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用有較為廣闊的市場前景。

香蔥獨特的香辛氣味和許多生理功能均來源于其前體蒜氨酸(alliin)類物質(zhì)與內(nèi)源酶蒜氨酸酶(alliinase，EC4.4.1.4)發(fā)生酶促反應(yīng)產(chǎn)生的，目前國內(nèi)外許多學(xué)者對該反應(yīng)中起重要作用的蒜氨酸酶進行了大量研究，主要集中在分離純化方法、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能等的研究，其中對大蒜和洋蔥的研究尤為深入[8-15]。

但是，國內(nèi)外學(xué)者對蔥屬植物中香蔥蒜氨酸酶的研究卻甚少，盡管不同蔥蒜類植物編碼酶的基因具有較高的同源性，但不同的蒜氨酸酶之間在酶學(xué)性質(zhì)上仍存在一定差異[16-17]。國外研究中，Landshuter等[18]利用疏水交互作用層析、離子交換層析及凝膠滲透層析技術(shù)對熊蔥中蒜氨酸酶進行了分離純化，得到純化倍數(shù)為52倍的酶并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了研究；Manabe等[19]對韭蔥嫩芽中的蒜氨酸酶分離純化，達到電泳純，再利用DNA雜交技術(shù)，從韭蔥的cDNA文庫中，雜交篩選出編碼其蒜氨酸酶的cDNA克隆，并證明了其與大蒜、洋蔥等的同源性。而國內(nèi)相關(guān)的研究尚未見報道。因此，本實驗以新鮮香蔥蔥白為原料，對其蒜氨酸酶進行分離純化并研究其酶學(xué)性質(zhì)，旨在為香蔥的理論研究和產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香蔥產(chǎn)于湖北孝感，取蔥白部分。

S-甲基-L-半胱氨酸亞砜 上海共價化學(xué)科技有限公司；DEAE-52、5＇-磷酸吡哆醛(PLP) 上海源葉生物科技有限公司；Sephadex G200 美國Pharmacia公司；其他試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

HR2094型攪拌機 珠海飛利浦家電有限公司；Avanti J-E型高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；752型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；HD-5型電腦紫外檢測儀 上海青浦滬西儀器廠；DYCZ-24DN型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蒜氨酸酶活性測定

采用丙酮酸法[12]測定。取1mL底物與1mL酶液在25℃條件下反應(yīng)5min，立即加入10g/100mL三氯乙酸2mL終止酶促反應(yīng)，加入0.1g/100mL 2,4-二硝基苯肼溶液1mL在25℃顯色5min，再加入2.5mol/L NaOH溶液5mL，25℃保溫10min后于420nm波長處比色，以底物、鈍化酶、2,4-二硝基苯肼和NaOH等反應(yīng)體系為空白。以丙酮酸物質(zhì)的量(x，μmol)為橫坐標(biāo)，其420nm波長處的吸光度(y，A420nm)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝1.949x＋0.0035(R2＝0.9998)。

酶活力定義：在25℃，磷酸鹽緩沖液A(50mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，含25μmol/L PLP，pH7.0)中，底物濃度為10mmol/LS-甲基-L-半胱氨酸亞砜的條件下，每分鐘反應(yīng)產(chǎn)生1μmol丙酮酸定義為1個酶活力單位。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍G250法[20]測定。以蛋白質(zhì)質(zhì)量(x，μg)為橫坐標(biāo)，其在595nm波長處的吸光度(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.0065x＋0.0018(R2＝0.9997)。

1.3.3 香蔥中蒜氨酸酶的分離純化

1.3.3.1 粗酶液提取

取100g新鮮香蔥蔥白，加入經(jīng)4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液B(50mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，含5g/100mL NaCl、體積分數(shù)10%甘油、5mmol/L EDTA-Na2、25μmol/L PLP，pH7.0)200mL，以最大速度破碎均漿5min，均漿液經(jīng)200目尼龍布過濾，濾液15000×g冷凍離心30min，得上清液即為蒜氨酸粗酶液。

1.3.3.2 硫酸銨鹽析

取蒜氨酸粗酶液各15mL，分別加入固體硫酸銨，使其飽和度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，攪拌充分后4℃靜置4h，15000×g冷凍離心30min，測定上清液的蛋白質(zhì)含量和酶活力，并繪制鹽析曲線以確定硫酸銨鹽析最適飽和度。

1.3.3.3 透析除鹽

將最適硫酸銨飽和度條件下沉淀所得的酶復(fù)溶于磷酸鹽緩沖液C(50mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，含1g/100mL NaCl、10g/100mL蔗糖、25μmol/L PLP，pH7.0)，裝入截留分子質(zhì)量8000～10000u透析袋中，置于1000mL蒸餾水(含體積分數(shù)10%甘油)4℃透析過夜。

1.3.3.4 DEAE-52離子交換層析

將處理好的DEAE-52離子交換纖維素填料裝柱(1.0cm×50cm)，用洗脫液A(20mmol/L NaH2PO4-NaH2PO4，含0.1mol/L NaCl、25μmol/L PLP，pH7.2)洗脫平衡。取透析后的濃縮酶液2mL(酶液是經(jīng)30%～60%硫酸銨分級沉淀、磷酸鹽緩沖液復(fù)溶、含體積分數(shù)10%甘油的蒸餾水透析后濃縮所得)上樣，依次用洗脫液A和洗脫液B(20mmol/L NaH2PO4-NaH2PO4，含0.2mol/L NaCl、25μmol/L PLP，pH7.2)進行線性分步洗脫，流速為0.5mL/min，用紫外檢測儀在280nm波長處進行檢測，分管收集，每管收集5mL，分別測定每管洗脫液中蛋白質(zhì)含量和蒜氨酸酶活力，繪制洗脫曲線，收集、合并酶比活力較高的洗脫液，經(jīng)透析、濃縮后作下一步純化。

1.3.3.5 Sephadex G200凝膠過濾層析

將處理好的Sephadex G200凝膠填料裝柱(1.6cm× 60cm)，用洗脫液C(50mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，含1g/100mL NaCl、25μmol/L PLP，pH7.0)洗脫平衡。取1.3.3.4節(jié)中的濃縮酶液5mL上樣，用洗脫液C以0.5mL/min流速線性洗脫，用紫外檢測儀在280nm波長處進行檢測，分管收集，每管收集3mL，分別測定每管洗脫液中蛋白質(zhì)含量和蒜氨酸酶活力，繪制洗脫曲線。最終收集得到純度較高的蒜氨酸酶。

1.3.3.6 純度鑒定

采用SDS-PAGE(其分離膠質(zhì)量濃度為12.5g/100mL，濃縮膠質(zhì)量濃度為5g/100mL)對最終的純化蒜氨酸酶進行純度鑒定并計算其亞基的分子質(zhì)量。

1.3.4 蒜氨酸酶的酶學(xué)性質(zhì)測定

1.3.4.1 最適反應(yīng)溫度

在pH值為7.0時，測定不同反應(yīng)溫度(15～70℃)條件下蒜氨酸酶活力，確定其最適反應(yīng)溫度。

1.3.4.2 最適pH值

在溫度為45℃時，測定不同pH值(3.0～10.0)條件下蒜氨酸酶活力，確定其最適pH值。

1.3.4.3 最適底物濃度及米氏常數(shù)

在最適反應(yīng)溫度和pH值條件下，以S-甲基-L-半胱氨酸亞砜為底物，測定不同底物濃度(1～20mmol/L)條件下蒜氨酸酶活力，確定其最適底物濃度。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，求出其米氏方程、米氏常數(shù)(Km)及最大反應(yīng)速度(Vmax)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜氨酸酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨鹽析曲線

圖1 硫酸銨分離蒜氨酸酶的鹽析曲線Fig.1 Ammonium sulfate precipitation curve of crude alliinase

由圖1可知，當(dāng)硫酸銨飽和度為0～30%時，隨著硫酸銨飽和度增大，上清液中蛋白質(zhì)含量降低較快，而蒜氨酸酶活力基本不變；當(dāng)硫酸銨飽和度為60%時，大部分蒜氨酸酶已被沉淀出來，繼續(xù)增加硫酸銨飽和度，酶活力降低不明顯而蛋白質(zhì)含量仍繼續(xù)減少。因此，選擇飽和度為30%～60%硫酸銨來分級沉淀蒜氨酸粗酶液可除去部分雜蛋白，實現(xiàn)目的蛋白的初步純化。經(jīng)實驗測定，粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀后，純化倍數(shù)為粗酶的1.6倍，酶活回收率達80%。

2.1.2 DEAE-52離子交換層析曲線

圖2 DEAE-52柱分離蒜氨酸酶洗脫曲線Fig.2 Elution curve of alliinase on DEAE-52 column

由圖2可知，當(dāng)洗脫時間為0.3～1.2h時(第2～7管)，出現(xiàn)第1個蛋白峰，洗脫液中含有一定質(zhì)量的蛋白質(zhì)，但沒有檢測出蒜氨酸酶活力，為無酶活力的雜蛋白；當(dāng)洗脫時間為1.6～3.0h時(第10～18管)，出現(xiàn)第2個蛋白峰，其中第10～15管均檢測出蒜氨酸酶活力，以第11、12管酶比活力較高，酶比活力分別為2.97、1.40U/mg，第11管酶比活力最大，其純化倍數(shù)是粗酶的5.1倍。

2.1.3 Sephadex G200凝膠過濾層析曲線

圖3 Sephadex G200柱分離蒜氨酸酶洗脫曲線Fig.3 Elution curve of alliinase on Sephadex G200 column

由圖3可知，當(dāng)洗脫時間為0.7～1.7h時(第7～17管)，出現(xiàn)第1個蛋白峰，其中8～13管均檢測出蒜氨酸酶活力，以9、10管酶比活力較高，第9管表現(xiàn)出最大酶比活力；當(dāng)洗脫時間為2.1～3.0h時(第21～30管)，出現(xiàn)第2個蛋白峰，但無蒜氨酸酶活力，為雜蛋白。經(jīng)過以上分離純化步驟(表1)，最終可得純化倍數(shù)達19.6倍的蒜氨酸酶，酶比活力為11.44U/mg，可見香蔥中蒜氨酸酶的酶比活力明顯小于大蒜中的，不同的純化方法得到的大蒜氨酸酶的比活力一般在30～200U/mg之間[9,11,13-15]，說明不同植物種類的蒜氨酸酶含量存在差異。收集合并Sephadex G200第9、10管洗脫液進行純度鑒定及進一步的酶學(xué)性質(zhì)研究。

表1 蒜氨酸酶的分離純化結(jié)果Table 1 Isolation and purification results of alliinase

2.1.4 SDS-PAGE電泳結(jié)果

蒜氨酸粗酶液、DEAE-52第11管洗脫液及Sephadex G200第9管洗脫液進行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見圖4。

圖4 香蔥中蒜氨酸酶SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE of alliinase from chive

由圖4可知，蒜氨酸酶經(jīng)分離純化步驟最終得到的酶(泳道3)在電泳圖譜上顯示出單一條帶，表明所得酶純度較高，達到電泳純。同時由電泳圖譜測得蒜氨酸酶亞基的相對遷移率Rm＝0.467，根據(jù)電泳圖譜上標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)值(y)與相對遷移率(x)的線性回歸方程：y＝－0.9764x＋5.1928，可計算得出蒜氨酸酶亞基的分子質(zhì)量約為54.5ku。已有相關(guān)文獻[8-9,11]報道大蒜中蒜氨酸酶是由2個分子質(zhì)量均為54ku的亞基結(jié)合的二聚體，而洋蔥中蒜氨酸酶是含4個分子質(zhì)量均為50ku亞基的四聚體[12]，由此可見，香蔥中蒜氨酸酶的亞基與大蒜和洋蔥中的有所不同，并且其全酶的分子質(zhì)量還有待進一步測定。

2.2 蒜氨酸酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適反應(yīng)溫度

圖5 溫度對蒜氨酸酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on alliinase activity

由圖5可知，香蔥中蒜氨酸酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，此時酶比活力達到最大值為10.02U/mg，在35～55℃溫度范圍內(nèi)蒜氨酸酶活力較高，當(dāng)溫度高于55℃時其酶比活力迅速降低，達到65℃時其活性完全喪失。由此可見，香蔥蒜氨酸酶的最適反應(yīng)溫度高于大蒜蒜氨酸酶的(35℃左右)[13-14]和洋蔥蒜氨酸酶的(30℃左右)[17]。

2.2.2 最適pH值

圖6 pH值對蒜氨酸酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on alliinase activity

由圖6可知，香蔥中蒜氨酸酶的最適pH值為7.0，此時酶比活力達到最大值為9.45U/mg，pH值為6.0～8.0范圍內(nèi)蒜氨酸酶活力較高，當(dāng)pH值大于8.5或小于5.5時，其酶活力較低。由此可見，香蔥蒜氨酸酶的最適pH值介于大蒜蒜氨酸酶的(pH6.5)[13-14]和洋蔥蒜氨酸酶的(pH8.5)[17]之間。

2.2.3 最適底物濃度及米氏常數(shù)

圖7 底物濃度對蒜氨酸酶活力的影響Fig.7 Effect of substrate concentration on alliinase activity

在酶質(zhì)量濃度(酶比活力約11U/mg)一定、pH7.0及溫度45℃條件下，底物濃度和蒜氨酸酶反應(yīng)速率的關(guān)系見圖7。當(dāng)?shù)孜餄舛龋?5mmol/L時，隨著底物濃度的增大，蒜氨酸酶促反應(yīng)速度呈近乎線性增大的趨勢；當(dāng)?shù)孜餄舛龋?5mmol/L時，酶促反應(yīng)速度隨底物濃度的增大幾乎不再改變。因此，其酶促反應(yīng)的最適底物濃度為15mmol/L。

由圖7結(jié)果及利用Lineweaver-Burk作圖法可得出蒜氨酸酶動力學(xué)的雙倒數(shù)線性回歸方程如圖8所示：y＝1.1237x＋0.0248(R2＝0.9946)，由此計算得到Km＝45.31mmol/L，Vm＝40.32μmol/(mg·min)。這與大蒜和洋蔥蒜氨酸酶的動力學(xué)特性均存在較大差異，與反應(yīng)底物的不同及酶本身的差異性有關(guān)，再次說明同屬植物且親緣關(guān)系相近種的蒜氨酸酶之間也具有一定的差異性。

圖8 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求KmFig.8 Lineweaver-Burk plot of alliinase activity

3 結(jié) 論

新鮮香蔥蔥白在pH7.0磷酸鹽緩沖液中均漿、離心提取得到粗酶液，經(jīng)30%～60%硫酸銨分級沉淀、透析除鹽、DEAE-52離子交換層析和Sephadex G200凝膠過濾層析后，可分離純化得到純度較高的蒜氨酸酶，純化倍數(shù)達19.6倍，酶比活力為11.44U/mg，酶活回收率為32.1%。經(jīng)鑒定，純化得到的蒜氨酸酶達到電泳純，其亞基的分子質(zhì)量約為54.5ku。

對純化的蒜氨酸酶進行酶學(xué)性質(zhì)測定，結(jié)果顯示其最適反應(yīng)溫度為45℃，最適pH值為7.0，以S-甲基-L-半胱氨酸亞砜為底物，蒜氨酸酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)線性回歸方程為y＝1.1237x＋0.0248(R2＝0.9946)，Km為45.31mmol/L，Vm為40.32μmol/(mg·min)。

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Purification and Enzymatic Properties of Alliinase from Chive (Allium schoenoprasumL.)

FU Yi-fan，ZHOU Yu，LI Xing-xin，LIU Ying，WANG Lu-feng，PAN Si-yi*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Alliinase (EC 4.4.1.4) was isolated from stalks of chive (Allium schoenoprasumL.), and its enzymatic properties were investigated. The enzyme was purified to apparent homogeneity using various steps, including homogenizing, centrifuging, ammonium sulfate precipitating, dialyzing, DEAE-52 ion exchange chromatography and Sephadex G200 gel filtration chromatography. SDS-PAGE electrophoresis was used to analyze the purity of alliinase. The results showed that the purity of alliinase was high and reached up to electrophoresis purity. The molecular weight of the subunit was 54.5 ku. The specific activity of the pure alliinase was 11.44 U/mg, and the activity recovery rate was 32.1%, which exhibited 19.6-fold enhancement in purity. The optimal reaction temperature and pH of purified alliinase were 45 ℃ and 7.0, respectively. Kinetic studies showed thatKm andVmax of alliinase usingS-methyl-L-cysteine sulfoxide as the substrate were 45.31 mmol/L and 40.32 μmol/ (mg·min), respectively.

chive (Allium schoenoprasumL.)；alliinase；isolation and purification；enzymatic properties

TS255.1

A

1002-6630(2012)05-0129-05

2011-05-19

付一帆(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：fuyifan@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：潘思軼(1964—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：pansiyi@mail.hzau.edu.cn