葡萄籽和皮萃取物對小鼠乳腺癌細胞遷移的影響

梁志強，陳秋宇，孫向軍,*

(1.山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801；

2.上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 200240)

葡萄籽和皮萃取物對小鼠乳腺癌細胞遷移的影響

梁志強1，陳秋宇2，孫向軍2,*

(1.山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801；

2.上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 200240)

目的：研究葡萄籽和皮萃取物對乳腺癌細胞遷移的抑制作用，以及對細胞活力的影響。方法：以小鼠乳腺癌細胞4T1為研究對象，四甲基偶氮唑鹽(MTT)實驗檢測細胞增殖活性；細胞遷移實驗檢測細胞遷移能力；結果：質量濃度為5μg/mL的葡萄籽和皮萃取物對乳腺癌細胞的遷移具有明顯的抑制作用，該抑制作用與藥物質量濃度呈現(xiàn)劑量依賴關系；萃取物對癌細胞的活力有明顯的抑制作用，葡萄籽和皮萃取物的半數(shù)有效質量濃度(IC50)分別為65.427μg/mL和72.408μg/mL。

葡萄籽和皮萃取物；鼠乳腺癌細胞；細胞活力；細胞遷移

近年來，葡萄作為藥食兼用植物，其醫(yī)療保健作用受到國內外預防醫(yī)學領域的廣泛關注。葡萄中富含葡萄糖、無機鹽、維生素以及多種生物活性成分[1]，葡萄籽和皮中的活性成分主要是多酚類化合物，果皮中主要有花色素類、白藜蘆醇及黃酮類，籽中主要為原花青素、兒茶素、槲皮苷、單寧等。其中主要的生物活性成分是原花青素，其結構中存在兩種最基本的單體：兒茶素和表兒茶素，這兩種單體通過聚合可形成寡聚體或多聚體，2～5聚體稱為低聚體(olig o me ric procyanidins，OPCs)，5聚體以上則稱為高聚體(procyanidolic polymers，PPCs)[2]，即低聚原花青素和高聚原花青素。其中OPCs的生物活性最強。

據(jù)國內外相關文獻報道，葡萄來源的多酚類化合物的生物活性涉及抗氧化、預防心血管疾病及抑制腫瘤生長等作用。其中，原花青素與大多數(shù)黃酮相比，水溶性好，有效性高，生物利用度在90%以上，極易被人體吸收[3]。Merfort等[4]采用化學發(fā)光法研究了葡萄籽原花青素對中性粒細胞中的自由基清除作用，結果表明葡萄籽原花青素具有較強的抗超氧陰離子自由基和抗脂質過氧化活性。Vinson等[5]給倉鼠喂食含高脂肪的食物并從中挑選出患動脈粥樣硬化的個體，而后用含有原花青素的葡萄籽提取物喂食，結果發(fā)現(xiàn)倉鼠的總膽固醇量降低了32%。Ye等[6]用葡萄籽提取物原花青素作用于人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A-427、人胃腺癌細胞CRL-1739，都有明顯的抑制作用。而對慢性骨髓性白血病細胞K562無細胞毒作用。Zao等[7]用原花青素作用于12-O-tetraecanoylphorbol-13-acetate (TPA)誘導的鼠皮膚癌癥模型，可以使鳥氨酸脫羧酶(ODC)和髓過氧化物酶(MPO)活性降低。研究表明葡萄原花青素能夠抑制腫瘤生長，降低腫瘤發(fā)生率，減少腫瘤數(shù)量以及縮小腫瘤體積，并且在抗輻射、抗衰老以及治療炎癥等方面均有很好的療效[8]。葡萄殘渣中的白藜蘆醇也是一種重要的功能性成分，具有顯著的體外抗氧化活性，在醫(yī)藥和食品工業(yè)領域具有廣泛的應用前景[9]。白藜蘆醇還是一種天然的抗癌活性物質，對乳腺癌、胃癌、皮膚癌、前列腺癌、胰腺癌等都有抑制作用[10]。此外，葡萄殘渣中還含有沒食子酸、槲皮苷等酚酸類物質，也具有抗氧化[11]及抗癌作用[12]?？梢?，葡萄籽和皮提取物中含有的多種具有抗癌作用的多酚類化合物，可能成為未來重要的天然抗癌藥物來源。

目前，女性乳腺癌發(fā)病率有上升的趨勢，發(fā)病年齡有提前的跡象。乳腺癌已成為了女性健康的危險因素，受到社會的關注。乳腺癌轉移、擴散是導致患者死亡的主要原因，而目前能有效控制乳腺癌轉移的治療方法是很有限的。飲食中的多酚類化合物具有抗腫瘤活性，研究表明葡萄中的多酚化合物能夠有效抑制接種在小鼠體內的乳腺癌細胞的生長[13]。葡萄皮、葡萄籽是釀酒工業(yè)的廢棄物，也是葡萄中多酚類化合物的主要來源。目前對于葡萄籽、葡萄皮中多酚化合物抑制乳腺癌活性的研究主要集中于對腫瘤生長和凋亡的作用，關于其對乳腺癌細胞轉移的影響較少涉及。本實驗著重研究葡萄籽、皮萃取物對小鼠乳腺癌細胞4T1遷移的抑制作用，為深入探討葡萄中多酚類化合物抑制乳腺癌轉移機理提供實驗依據(jù)，為有效控制乳腺癌轉移提供一個新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠乳腺癌4T1細胞株由上海交通大學提供，在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃、5% CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

葡萄籽和葡萄皮萃取物粉末(品種為法國霞多麗，原花青素含量≥95.0%，低聚原花青素含量≥60.0%) 天津市尖峰天然產物研究開發(fā)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶 吉諾醫(yī)藥生物技術有限公司；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 碧云天生物技術研究所。

1.2 儀器與設備

CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；超凈工作臺 造鑫企業(yè)有限公司；Labsystems Dragon Wellscan MK-3 全自動多功能酶標儀 北京鑫諾恒信科技發(fā)展有限公司；倒置顯微鏡 日本Nikon公司；趨化小室(Boyden Chamber) 美國Costar公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄籽和皮原液的制備

稱取葡萄籽、皮萃取物粉末20mg，溶于2mL無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，0.22μm微膜過濾，再用錫箔紙包裹，備用。

1.3.2 四甲基偶氮唑鹽法(MTT)實驗

參照Mosmann[14]建立的MTT法，檢測萃取物對4T1細胞生長的抑制作用。葡萄籽、皮萃取物設5個終質量濃度為：5、10、20、50、100μg/mL的劑量組，同時設置不加萃取物的對照組。

收集對數(shù)期細胞，調整細胞懸液濃度，接種于24孔板中，每孔1×105個細胞，體積500μL，每個劑量組重復4孔。5% CO2，37℃過夜貼壁，加入不同質量濃度葡萄籽、皮萃取物。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，去舊培養(yǎng)基，每孔加入500μL新鮮培養(yǎng)基和50μL MTT溶液(50μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內培養(yǎng)基，每孔加入500μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。再轉至96孔板，用自動酶標儀測波長490nm處的OD值。通過生長曲線，查對應的細胞數(shù)，計算細胞存活率和細胞抑制率，如式(1)、(2)。通過改良寇式法計算半數(shù)有效質量濃度(IC50)，計算最大無毒質量濃度(TC0)。IC50即細胞存活率為50%時的萃取物質量濃度；TC0為細胞存活率大于95%時的藥物質量濃度，一般認為其為萃取物作用的安全質量濃度[15]。

1.3.3 細胞遷移實驗

細胞遷移實驗參照參考文獻[16]進行，收集對數(shù)期細胞，用RPMI1640培養(yǎng)基懸浮(陽性對照組加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，不加樣品)，加載到Boyden Chamber上室，調整細胞濃度為5×105個/mL，每孔樣品體積為100μL。實驗組萃取物質量濃度為0.1、0.5、1、5、10μg/mL，對照組不加藥。下室加入含有與上室相同藥物質量濃度的無血清培養(yǎng)基，每孔600μL；每組設3個復孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)2h。取出Transwell小室，把下室換成含相同質量濃度萃取物的新鮮培養(yǎng)基(含10% FBS)，對照組的下室也換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。濾膜經4%多聚甲醛固定，伊紅-蘇木素染液染色，PB S沖洗，制片，最后計數(shù)。按式(3)計算遷移率。

2 結果與分析

2.1 細胞接種濃度的篩選

細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一。本實驗以不同濃度的4T1細胞培養(yǎng)24h后，MTT實驗檢測活細胞數(shù)，用酶標儀測其OD值，即得生長曲線。

圖1 細胞濃度生長曲線Fig.1 Growth curve of mouse mammary carcinoma 4T1 cells

由圖1可知，在細胞濃度為5×104～5×105個/mL之間，斜率較大，細胞增殖最旺盛，細胞分裂增多，成倍增長，活力最佳。綜合考慮故選(1～2)×105個/mL的細胞濃度作為MTT實驗的起始細胞濃度。

2.2 葡萄籽和皮提取物對4T1生長抑制作用

表 1 葡萄籽、葡萄皮提取物對4T1細胞的生長抑制作用Table 1 Inhibitory effects of grape seed and skin extracts on mouse mammary carcinoma 4T1 cells

從表 1可見，葡萄籽和葡萄皮萃取物在5μg/mL的條件下，細胞存活率＞95%，即 TC0為5μg/mL，可認為葡萄籽和葡萄皮萃取物在此質量濃度下對4T1細胞的增殖無毒性作用。隨著藥物質量濃度的增大，其對細胞增殖的毒性作用增大。計算可知，葡萄皮的IC50為72.408μg/mL，葡萄籽的IC50為65.427μg/mL，以上結果表明，經相同質量濃度的葡萄籽萃取物與葡萄皮萃取物處理4T1細胞，其中葡萄籽萃取物處理的細胞存活率較低，抑制率較高，說明葡萄籽萃取物對4T1細胞生長的抑制作用大于葡萄皮萃取物。

2.3 葡萄籽、皮提取物對4T1遷移運動的抑制作用

經不同質量濃度的葡萄籽、皮萃取物分別處理4T1細胞，采用細胞遷移實驗研究提取物對4T1遷移運動的抑制作用，結果見圖2～5。

圖2 葡萄皮萃取物對4T1細胞遷移率的影響Fig.2 Effect of grape skin extract on the migration of mouse mammary carcinoma 4T1 cells

圖3 不同質量濃度的葡萄皮萃取物處理的4T1細胞遷移的圖片(×100)Fig.3 Cell migration after treatment with grape skin extract at various concentrations (×100)

圖4 葡萄籽萃取物對4T1細胞遷移率的影響Fig.4 Effect of grape seed extract on the migration of mouse mammary carcinoma 4T1 cells

圖5 不同濃度的葡萄籽萃取物處理的4T1細胞遷移的圖片(×100)Fig.5 Cell migration after treatment with grape seed extract at various concentrations (×100)

由圖2～5可見，葡萄籽、皮提取物能夠顯著抑制4T1細胞的遷移，并且抑制作用呈劑量依賴性。在高倍鏡下觀察，藥物處理組發(fā)生遷移的細胞數(shù)顯著低于對照組，而且與藥物質量濃度呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關系。結果也表明，在相同質量濃度情況下葡萄籽提取物對細胞遷移的阻斷作用要強于葡萄皮提取物。

3 結 論

乳腺癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的生命健康。近些年來，由于對乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，以及綜合治療手段的不斷提高，其死亡率呈逐年下降趨勢。盡管如此，乳腺癌患者在初次治療后轉移仍然是治療失敗的主要原因[17]。我們知道，惡性腫瘤轉移是一個高度受控的、多因子參與的、涉及多個環(huán)節(jié)的級聯(lián)反應過程，腫瘤細胞從原發(fā)病灶脫落后，侵人周圍基質和正常細胞之間，并突破基底膜屏障進入血管或淋巴管向全身擴散，最后在遠處器官形成新的轉移灶[18]。因為轉移腫瘤治療效果差，僅少數(shù)患者對當前的治療敏感，研究乳腺癌的發(fā)病機制，尋找新的抑制其浸潤轉移的治療藥物，對于降低乳腺癌的死亡率，延長患者的壽命，具有十分重要的意義。

細胞遷移實驗是一個檢測細胞侵襲和遷移能力的模型。即通過血清誘導，4T1細胞會朝含有血清的濾膜一側遷移，它可以較真實地模擬體內情況，并能有效地記錄細胞遷移特征如細胞形態(tài)的改變和遷移細胞數(shù)。細胞遷移實驗的結果可以反映細胞的遷徙活性，與癌細胞的轉移、擴散密切相關。在本實驗中，用不同質量濃度的葡萄籽和葡萄皮萃取物處理4T1細胞，考察萃取物對細胞遷移的抑制作用，從而推斷其對乳腺癌細胞轉移、擴散的抑制作用，結果表明遷移到膜背面的4T1細胞數(shù)量的減少與萃取物成劑量依賴性。

MTT實驗發(fā)現(xiàn)，葡萄皮萃取物的IC50為72.408μg/mL，葡萄籽的IC50為65.427μg/mL，它們的TC0都為5μg/mL。遷移實驗結果表明，5μg/mL葡萄籽萃取物對4T1細胞遷移的抑制率＞70%，當萃取物質量濃度達到10μg/mL時，對4T1細胞遷移的抑制率＞90%。5μg/mL葡萄皮萃取物對4T1細胞遷移的抑制率＞60%，當萃取物質量濃度達到10μg/mL時，對4T1細胞遷移的抑制率＞80%。葡萄籽、皮萃取物在安全質量濃度范圍內抑制了4T1細胞的遷移，并成劑量依賴關系，這說明葡萄籽、皮萃取物對4T1細胞遷移的抑制作用不是通過直接殺死細胞或抑制細胞繁殖而實現(xiàn)的。對葡萄籽、皮萃取物抑制乳腺癌轉移機理的深入研究，將對開發(fā)安全、有效治療乳腺癌新藥具有重要價值。

在相同質量濃度的葡萄籽和葡萄皮萃取物條件下，葡萄籽的抑制作用要強于葡萄皮。這主要是由于它們兩者的主要成分不同，因此也表現(xiàn)出不同的生物活性。Monagas等[19]的研究中，葡萄籽萃取物中的低聚原花色素和黃烷-3-醇(兒茶素、表兒茶酸)濃度遠高于皮，葡萄籽中大約含有2.3～8.2mg/g的黃烷-3-醇和沒食子酸，是葡萄皮含量的20倍。而葡萄皮中的高聚原花青素的含量要比籽的多。此外，槲皮素、白藜蘆醇、酚酸等多酚類化合物也發(fā)揮了重要的作用。Garcia-Mediero等[20]用槲皮素、沒食子酸、白藜蘆醇等處理鼠的膀胱癌細胞(MB-49)，結果發(fā)現(xiàn)它們都具有抑制MB-49的作用，其中25mmol/L白藜蘆醇和10mmol/L槲皮素可以誘導MB-49的凋亡，而且槲皮素可以有效的抑制MB-49的遷移，有效率高達40%。這說明葡萄籽萃取物中不僅是原花青素在起作用，還有一些其他的活性物質，抑制效果明顯要比葡萄皮萃取物好。

葡萄是全世界種植最廣泛、產量最大的水果之一，年均葡萄酒產量在267～300億L之間，釀酒廢棄物大約占葡萄總量的20%[21]，因此對葡萄酒廢棄物的再利用引發(fā)新的研究熱點。根據(jù)國家統(tǒng)計局公布的數(shù)據(jù)，2009年全年葡萄酒產量為96萬t，增速27.63%。葡萄酒產量的大幅提高也帶來了釀酒廢棄物的迅速增加，因此充分利用釀酒殘渣生產高附加值產品不僅能夠緩解我國的環(huán)境污染問題，而且能夠提高資源的利用水平，產生更高的經濟價值。

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Effects of Grape Seed and Grape Skin Extracts on the Migration of Mouse Mammary Carcinoma Cells

LIANG Zhi-qiang1，CHEN Qiu-yu2，SUN Xiangjun2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China；
2. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Objective: To explore the effects of grape seed and grape skin extracts on the migration, viability and proliferation of breast cancer cells. Methods: The viability of mouse mammary carcinoma 4T1 cells was determined by MTT assay and the migration ability by transwell chemotaxis assay. Results: Both grape seed and grape skin extracts significantly reduced the migration of the 4T1 cells in a dose-dependent manner, and exhibited an obvious inhibitory effect on cell migration at a concentration as low as 5μg/mL. The extracts also obviously inhibited the viability and proliferation of the 4T1 cells with IC50(half maximal inhibitory concentration) of 65.427μg/mL and 72.408μg/mL, respectively.

grape seed and grape skin extracts；mouse mammary carcinoma cells；viability；migration

Q279

A

1002-6630(2012)01-0239-05

2011-02-28

上海市科委技術標準專項(07DZ05019)

梁志強(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與衛(wèi)生。E-mail：lzqiang19850405@163.com

*通信作者：孫向軍(1967—)，女，副教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：xjsun@sjtu.edu.cn