誘導(dǎo)物對出芽短梗霉木聚糖酶活力和阿魏酰低聚糖合成的調(diào)控影響

張雨青，余曉紅,,*，顧振新，屠 康

(1.鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224003；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

誘導(dǎo)物對出芽短梗霉木聚糖酶活力和阿魏酰低聚糖合成的調(diào)控影響

張雨青1，余曉紅1,2,*，顧振新2，屠 康2

(1.鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224003；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

以麥麩為原料誘變選育的不產(chǎn)黑色素出芽短梗霉為發(fā)酵菌株，利用其發(fā)酵過程中合成的木聚糖酶水解麥麩纖維，制備阿魏酰低聚糖(FOs)。研究碳源、氮源、金屬離子和表面活性劑等誘導(dǎo)物對出芽短梗霉木聚糖酶活力和FOs合成的影響，以探明各物質(zhì)對出芽短梗霉木聚糖酶活力和FOs合成的影響；利用正交試驗設(shè)計方法研究各物質(zhì)添加量對出芽短梗霉產(chǎn)酶和FOs的影響，確定芽短梗霉發(fā)酵制備FOs的最佳培養(yǎng)基。結(jié)果表明：50g/L麥麩處理液中添加15g/L葡萄糖、1g/L蛋白胨和1g/L玉米漿，F(xiàn)Os產(chǎn)量和木聚糖酶活力最高分別達到627nmol/L和52.66IU/mL。

麥麩；阿魏酰低聚糖；誘導(dǎo)物；合成調(diào)控；出芽短梗霉

阿魏酰低聚糖(feruloyl oligosaccharides，F(xiàn)Os)是阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)與糖的羥基通過酯鍵聯(lián)接成的一類重要的功能性低聚糖，廣泛存在于禾本科植物中[1]。FOs的制備方法有化學(xué)法[1]、物理法[2]和生物法[3]?；瘜W(xué)法和物理法因存在反應(yīng)條件苛刻、產(chǎn)物易分解等缺點而較少使用，目前使用最多的是生物酶法。生物酶法是以不溶性膳食纖維為原料[3]，利用半纖維素酶等水解獲取FOs，該方法反應(yīng)溫和、操作簡便，但生產(chǎn)中增加了不溶性膳食纖維的制備工藝，步驟復(fù)雜。

生物發(fā)酵法已用于膳食纖維的制備[4]。該方法在FOs制備中報道較少，僅見Ferreira等[5]在用鏈霉菌發(fā)酵甜菜漿時，檢出多聚半乳糖醛酸酶、阿魏酸酯酶、FOs和阿魏酸，表明微生物發(fā)酵制備FOs具有可行性。發(fā)酵法制備FOs旨在利用菌體生成的胞外酶水解麥麩細(xì)胞壁，釋放FOs，其中木聚糖酶是該過程的關(guān)鍵酶[3]，因而發(fā)酵過程中木聚糖酶活性至關(guān)重要。在發(fā)酵工藝中，影響產(chǎn)物生成的因素很多，其中培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件對微生物生長、產(chǎn)酶及其代謝物質(zhì)的生成影響顯著[6]。

本課題組誘變選育獲得高產(chǎn)木聚糖酶、不產(chǎn)阿魏酸酯酶的出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans)，其發(fā)酵液中檢出大量的FOs，可將此菌株用于發(fā)酵麥麩制備FOs，該方面研究未見報道。擬通過比較碳源、氮源、金屬離子和表面活性劑等誘導(dǎo)物成分對出芽短梗霉生成木聚糖酶和FOs的影響，以確定出芽短梗霉發(fā)酵制備FOs的最佳培養(yǎng)基組成，為后續(xù)進一步研究出芽短梗霉發(fā)酵法制備FOs的最佳工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

麥麩由江蘇省泰興市紛華面粉有限公司提供。

出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)購自廣東微生物研究所。

乳糖、蔗糖、木糖、ZnSO4、Fe2(SO4)3、Ca(CO3)2(均為分析純) 南京化學(xué)試劑有限公司；吐溫-80、植物油、蔗糖酯(均為食品級) 山東海杰化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；GL21R冷凍離心機 上海知正離心機有限公司；Agilent 1200液相色譜儀 美國Agilent公司；DZ-900往復(fù)式搖床 太倉實驗設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 麥麩液制備工藝流程

麥麩烘干→粉碎過40目篩子篩分→用2%硫酸溶液調(diào)pH值至5.5，并調(diào)節(jié)至50g/L→50℃保溫2h

1.3.2 培養(yǎng)基的制備

保藏培養(yǎng)基：酵母浸膏6.7g/L、葡萄糖10g/L、(NH4)2SO42g/L、KH2PO45g/L，瓊脂20g/L，pH值自然；母種培養(yǎng)基：酵母浸膏6.7g/L、葡萄糖10g/L、(NH4)2SO42g/L、KH2PO45g/L，pH值自然；碳源實驗用培養(yǎng)基：在麥麩液中添加10g/L的葡萄糖、木糖、乳糖、木聚糖、蔗糖；氮源實驗用培養(yǎng)基：在麥麩液中添加2g/L的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、豆粕、玉米漿、硫酸銨和硝酸銨；金屬離子實驗用培養(yǎng)基：在麥麩液中添加1mmol/L的Zn2+、Mg2+、Fe3+、Ca2+和K+；表面活性劑實驗用培養(yǎng)基：在麥麩液中添加1g/L的吐溫-80、植物油和蔗糖酯；麥麩培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)：50g/L的麥麩液，添加1g/L的KH2PO4和1g/L的MgSO4·7H2O和0.1g/L的VB1；以上培養(yǎng)基均采用高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度為121℃，時間20min。

1.3.3 菌種培養(yǎng)方法

母種培養(yǎng)：在溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，搖瓶裝液量為50mL/250mL三角瓶，接種1塊直徑約為4mm的母種菌塊，培養(yǎng)3d。

培養(yǎng)基確定用發(fā)酵條件：按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量取母種接種至已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃條件下180r/min往復(fù)搖床中培養(yǎng)，測定發(fā)酵液中木聚糖酶活力及FOs產(chǎn)量。

1.3.4 木聚糖酶活力測定

以燕麥木聚糖為底物，用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖的生成量。取0.5mL適當(dāng)稀釋的出芽短梗霉木聚糖酶粗酶液，加入1.5mL用0.2mol/L、pH4.8醋酸緩沖液配制的1g/100mL木聚糖溶液中，50℃酶解30min，加入1.5mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，沸水浴中加熱5min，用冰水迅速冷卻，定容到25mL，于520nm波長處測定OD值。同時以100℃滅活的粗酶液作對照，用木糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活力單位定義為上述條件下每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生1μmol木糖的酶量為一個酶活力單位(IU)。

1.3.5 FOs含量的測定[7]

樣品處理：將各菌的發(fā)酵液于4000r/min離心15min，上清液為含有FOs的樣品液。取樣品液1mL于10mL離心管中，添加1mL濃度為1mol/L的氫氧化鈉溶液，于100℃避光水解90min，使FOs水解，冷卻后用1mol/L鹽酸溶液中和。

樣品測定：采用HPLC法測定FOs樣品液及其水解液中阿魏酸含量，計算FOs樣品水解前后阿魏酸的增加量，即為F O s產(chǎn)量。

阿魏酸的液相色譜測定條件：采用Agilent TCC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，25℃，進行HPLC分離，檢測器為紫外檢測器(UV)。洗脫液為0.5%的三氟乙酸(A)和乙腈(B)，流速為0.6mL/min，梯度洗脫。進液量為20μL，檢測波長為325nm，洗脫順序見表1。

表1 阿魏酸洗脫順序Table 1 Elution program for frulic acid

1.3.6 試驗設(shè)計

以碳源、氮源、金屬離子、表面活性劑進行單因素試驗，考察其對FOs產(chǎn)量和木聚糖酶活力的影響，在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇在麥麩處理液中添加篩選出的對FOs產(chǎn)量和木聚糖酶活力呈正效應(yīng)的各因素，正交試驗設(shè)計按表2進行。

表2 培養(yǎng)基成分添加量正交試驗因素水平表Table 2 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對出芽短梗霉木聚糖酶和阿魏酰低聚糖合成的影響

在麥麩液中分別添加10g/L的葡萄糖、蔗糖、木糖、木聚糖和乳糖，考察碳源對出芽短梗霉生成木聚糖酶和F O s的影響，結(jié)果見表3、4。碳源對出芽短梗霉合成木聚糖酶和FOs具有一定的影響。在空白麥麩發(fā)酵液中，出芽短梗霉合成木聚糖酶活力為24.56IU/mL。葡萄糖、乳糖和木糖的添加對木聚糖酶和F O s的合成具有一定的促進作用，其中葡萄糖和乳糖效果最好。隨著發(fā)酵時間從4d延長到6d，F(xiàn)Os產(chǎn)量卻下降，可能出芽短梗霉因為自身生長代謝的需要，在碳源逐漸消耗的情況下，會誘導(dǎo)FO s降解酶的合成，從而分解FO s以供菌體自身生長代謝，所以后續(xù)研究中控制發(fā)酵時間為4 d。

碳源誘導(dǎo)微生物產(chǎn)酶已有大量研究，但對誘導(dǎo)出芽短梗霉產(chǎn)木聚糖酶的調(diào)控作用不多見。本研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖可促進出芽短梗霉菌體生長，類似于Kim等[8]的研究結(jié)果，可能緣于葡萄糖對出芽短梗霉菌體生長具有一定的促進作用，從而促進了木聚糖酶的合成。木聚糖未能促進出芽短梗霉木聚糖酶的合成，這區(qū)別于其他報道[9]，其原因可能是本研究采用麥麩處理液作為空白，考察碳源的添加對木聚糖酶合成的影響，而麥麩對木聚糖酶的合成具有很好的誘導(dǎo)作用[10-11]，誘導(dǎo)物則在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對其誘導(dǎo)酶才具有促進作用，質(zhì)量濃度增加效果不明顯甚至?xí)霈F(xiàn)抑制作用[12]，麥麩和木聚糖為木聚糖酶的同類誘導(dǎo)物，本研究中50g/L的麥麩已達到其對木聚糖酶的最佳誘導(dǎo)質(zhì)量濃度[13]，因而繼續(xù)添加木聚糖未能促進出芽短梗霉木聚糖酶的生成。此外，研究表明不同菌株的木聚糖酶合成誘導(dǎo)物不同[14]。

表3 碳源對出芽短梗霉木聚糖酶生成的影響Table 3 Effect of carbon sources on biosynthesis of xylanase in Aureobasidium pullulans

表4 碳源對出芽短梗霉阿魏酰低聚糖生成的影響Table 4 Effect of carbon sources on biosynthesis of FOs in Aureobasidium pullulans

2.2 不同氮源對出芽短梗霉木聚糖酶和阿魏酰低聚糖合成的影響

表5 氮源對出芽短梗霉生成木聚糖酶、阿魏酰低聚糖的影響Table 5 Effect of nitrogen sources on biosynthesis of xylanase and FOs in Aureobasidium pullulans

在麥麩處理液中分別添加酵母膏、蛋白胨等有機氮源和硫酸銨、硝酸銨等無機氮源使其質(zhì)量濃度為2g/L，測定FOs含量和木聚糖酶活力，以考察氮源對出芽短梗霉生成木聚糖酶和FOs的影響，結(jié)果見表5。相比于無機氮源，有機氮源更適于真菌的生長及其代謝產(chǎn)物的生成[15]。有機氮源對出芽短梗霉產(chǎn)酶及FOs的合成具有較大影響，不同氮源具有不同的影響。玉米漿、蛋白胨對出芽短梗霉木聚糖酶的合成促進作用顯著，顯著的提高了FOs產(chǎn)量。類似于Oliveira等[16]和Cai等[17]的研究結(jié)果。玉米漿對出芽短梗霉產(chǎn)酶影響的報道未見，本研究結(jié)果顯示玉米漿可促進出芽短梗霉木聚糖酶的合成和FOs產(chǎn)量的提高。Zhang Jianzhen等[18]研究表明銨鹽為氮源時出芽短梗霉合成木聚糖酶能力最強。有機氮源對木聚糖酶具有激活作用，其中蛋白胨效果最佳[19]；本研究結(jié)果與此類似，以蛋白胨為氮源時出芽短梗霉生成木聚糖酶活性較高。后續(xù)研究則以玉米漿和蛋白胨為氮源。

2.3 不同金屬離子對出芽短梗霉木聚糖酶和阿魏酰低聚糖合成的影響

表6 金屬離子對出芽短梗霉生成木聚糖酶、阿魏酰低聚糖的影響Table 6 Effect of metal ions on biosynthesis of xylanase and FOs in Aureobasidium pullulans

在麥麩處理液中，添加1mmol/L Zn2+、Mg2+、

Fe3+、Ca2+和K+等金屬離子，考察金屬離子對出芽短梗霉生成木聚糖酶及FOs的影響，結(jié)果見表6。金屬離子對出芽短梗霉木聚糖酶的合成和FOs的生成具有不同的影響趨勢，Ca2+、Mg2+和K+對木聚糖酶的合成具有促進作用，卻使FOs產(chǎn)量減少。由此可推斷發(fā)酵系統(tǒng)中FOs的產(chǎn)量下降不是緣于出芽短梗霉的消耗造成的，可能是出芽短梗霉木聚糖酶合成的同時，金屬離子Ca2+、Mg2+和K+也激發(fā)了出芽短梗霉生成其他可水解酶系[20]。研究已證實金屬離子可同時激活幾種酶活性[21]。

2.4 不同表面活性劑對出芽短梗霉木聚糖酶和阿魏酰低聚糖生成的影響

表7 表面活性劑對出芽短梗霉生成木聚糖酶和阿魏酰低聚糖的影響Table 7 Effect of surfactants on biosynthesis of xylanase and FOs in Aureobasidium pullulans

在麥麩處理液中，添加1g/L吐溫-80、植物油和蔗糖酯，考察表面活性劑對出芽短梗霉木聚糖酶生成和FOs產(chǎn)量的影響，結(jié)果見表7。在麥麩處理液中添加表面活性劑后，出芽短梗霉發(fā)酵系統(tǒng)中，木聚糖酶活力和FOs的產(chǎn)量均下降了。因此，在后續(xù)實驗中表面活性劑不再添加。Zeng Guangming等[22]研究表明表面活性劑添加量對Penicillium simplicissimum生成木聚糖酶具有一定的影響，質(zhì)量濃度低時可促進木聚糖酶的合成，質(zhì)量濃度過高則反之。Park等[23]研究表明適量植物油的添加可促進北蟲草菌體生長及多糖分泌，添加量過多則出現(xiàn)抑制作用。植物油與表面活性劑相似，均可改變細(xì)胞膜的通透性，使得菌體生長及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提高[24]；本研究以麥麩為發(fā)酵系統(tǒng)，因麥麩含有2.86%脂肪[7]，即培養(yǎng)基中已有一定濃度的油脂，因此，吐溫-80和植物油等表面活性劑的添加未能促進出芽短梗霉木聚糖酶的合成和FOs的形成。

綜上所述，由碳源、氮源、金屬離子和表面活性劑對出芽短梗霉產(chǎn)酶和FOs的影響結(jié)果可知，添加金屬離子和表面活性劑均未能提高出芽短梗霉發(fā)酵系統(tǒng)中FOs的產(chǎn)量，因而后續(xù)試驗中不再添加。葡萄糖、乳糖、玉米漿及蛋白胨對出芽短梗霉木聚糖酶活性和FOs生成均呈正效應(yīng)，具有促進作用，因此，后續(xù)試驗進一步考察此正效應(yīng)因素的最適添加量。

2.5 正交試驗結(jié)果

表8 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 8 Orthogonal array design and results

表9 正交試驗結(jié)果方差分析Table 9 Variance analysis for the experimental results of orthogonal array design

正交試驗方案及結(jié)果見表8。經(jīng)Design Expert 7.0軟件優(yōu)化得，出芽短梗霉生成木聚糖酶和FOs的最佳培養(yǎng)基組成分別為A4B2C2D2和A4B4C2D2；由極差分析(表8)和方差分析(表9)可知，葡萄糖、乳糖、蛋白胨和玉米漿添加量對FOs產(chǎn)量和木聚糖酶活力的影響順序均為A＞C＞D＞E＞B，其中A因素(葡萄糖添加量)對FOs產(chǎn)量的影響最為顯著，B因素(乳糖添加量)對FOs產(chǎn)量、木聚糖酶活力的影響均最小，故不作添加，為獲得出芽短梗霉發(fā)酵麥麩產(chǎn)阿魏酰低聚糖的最高產(chǎn)量，在培養(yǎng)基中添加葡萄糖、蛋白胨和玉米漿分別使其質(zhì)量濃度達到15、1g/L和1g/L時，出芽短梗霉發(fā)酵后可同時獲得最高產(chǎn)量的FOs和木聚糖酶，在該條件下，木聚糖酶活力和FOs產(chǎn)量分別為52.66IU/mL和627nmol/L。對實驗結(jié)果進行方差分析(表9)可知，葡萄糖對FOs產(chǎn)量的影響顯著。

3 結(jié) 論

出芽短梗霉在麥麩培養(yǎng)基中生長時能夠合成木聚糖酶，適量的葡萄糖、蛋白胨和玉米漿均能促進出芽短梗霉木聚糖酶的合成及FOs的生成，添加金屬離子和表面活性劑均未能提高出芽短梗霉發(fā)酵系統(tǒng)中FOs的產(chǎn)量。出芽短梗霉發(fā)酵制備FOs的培養(yǎng)基組成為：50g/L麥麩液中添加15g/L葡萄糖、1g/L蛋白胨和1g/L玉米漿；利用該培養(yǎng)基進行液態(tài)發(fā)酵，木聚糖酶活力可達52.66IU/mL，F(xiàn)Os產(chǎn)量達627nmol/L。為后續(xù)進一步研究出芽短梗霉發(fā)酵法制備FOs的最佳工藝提供參考。

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Effect of Inducers on Xylanase Activity and Biosynthesis of Ferulic Oligosaccharides inAureobasidium pullulans

ZHANG Yu-qing1，YU Xiao-hong1,2,*，GU Zhen-xin2， TU Kang2
(1. College of Chemistry and Biological Engineering, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224003, China；
2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Feruloyl oligosaccharides (FOs) could be produced as a result of the hydrolysis of wheat bran fiber by xylanase synthesized during fermentation by a mutant strain ofAureobasidium pullulanswithout the secretion of melanin bred using wheat bran. The effects of inducers such as carbon source, nitrogen source, metal ion and surfactant on the activity of xylanase and the formation of FOs were investigated. The medium composition for FOs production by the strain was optimized using the orthogonal array design method. The highest FOs production and xylanase activity, 627 nmol/L and 52.66 IU/mL, respectively,were achieved by using a medium comprised of 50 g/L wheat bran, 15 g/L glucose, 1 g/L peptone and 1 g/L corn syrup.

wheat bran；ferulic oligosaccharides；inducer；biosynthesis and control；Aureobasidium pullulans

Q939.97

A

1002-6630(2012)01-0209-06

2011-09-23

江蘇省社會發(fā)展科技支撐基金資助項目(BE2011728)；江蘇省高校自然科學(xué)基金資助項目(11KJB550005)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐基金資助項目(BE2010386)；江蘇省新型環(huán)保重點實驗室開放課題基金資助項目(AE201041)；鹽城市產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新基金項目(YKA201102)；鹽城市科技局工業(yè)支撐基金資助項目(Yk2009047)；鹽城工學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所開放基金資助項目(XKY2009004)

張雨青(1963—)，男，講師，本科，研究方向為化學(xué)工程。E-mail：yczyq@ycit.cn

*通信作者：余曉紅(1976—)，女，副教授，博士研究生，研究方向為食品微生物、天然產(chǎn)物分離及應(yīng)用。E-mail：yxh1127@163.com