高同型半胱氨酸血癥對平滑肌細胞的氧化損傷

李 燕 張春來 盧 峰 王立忠 姜玉鳳

(河北唐山工人醫(yī)院心內(nèi)4科，唐山 063000)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)又稱高半胱氨酸，是一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸(又稱蛋氨酸)的中間代謝產(chǎn)物。同型半胱氨酸血癥與許多疾病有關(guān)，血中Hcy升高可致流產(chǎn)、新生兒缺陷直至中風、老年性癡呆及其他老年性疾病如骨質(zhì)疏松等，尤其被認為Hcy升高是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)的一個獨立危險因素［1-2］。高同型半胱氨酸血癥可能與Hcy代謝有關(guān)的酶和維生素缺乏有關(guān)。近年來，大量研究［1］表明同型半胱氨酸是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的一個新的、重要的獨立危險因子，然而其致AS的機制尚未完全闡明。

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的遷移和增生是導致血管內(nèi)膜增厚及粥樣斑塊形成的關(guān)鍵?，F(xiàn)在關(guān)于Hcy致AS機制的研究大都在離體血管內(nèi)皮細胞或離體的平滑肌細胞株上完成，所使用的Hcy的濃度往往高出機體實際水平的數(shù)倍或數(shù)十倍，而Hcy對活體動物血管平滑肌細胞的氧化、增生的影響卻少見報道。因此，本研究用不同劑量高Hcy飼料飼喂新西蘭大白兔，觀察Hcy對兔頸動脈平滑肌細胞氧化損傷與增生的影響，進而探討Hcy引起AS的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型制備

40只新西蘭兔購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心〔動物許可證號:SYXK(冀)2007-0049〕，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后;用數(shù)字表法隨機分組分為5組，每組8只，模型1組為對照(control，C)組，飼喂不含蛋氨酸的普通飼料;第2組為模型1(model 1，M1)組，飼喂含2%蛋氨酸、6%花生油和92%普通顆粒飼料的高蛋氨酸飼料;第3組為模型2組(model 2，M2)，飼喂含4%蛋氨酸、6%花生油和90%普通顆粒飼料的高蛋氨酸飼料;第4組為模型3組(model 3，M3)，飼喂含6%蛋氨酸、6%花生油和88%普通顆粒飼料的高蛋氨酸飼料;第5組為模型4組(model 4，M4)，飼喂含10%蛋氨酸、6%花生油和84%普通顆粒飼料的高蛋氨酸飼料;飼喂8周后，每周定點抽取靜脈血，共采血5次，分別測Hcy濃度。喂養(yǎng)3個月至頸動脈粥樣硬化性狹窄模型建立。

1.2 兔頸動脈內(nèi)膜平滑肌分離

喂養(yǎng)3個月后，新西蘭兔手術(shù)當日清晨禁水禁食，稱體質(zhì)量，肌肉注射速眠新注射液(0.1 mL/kg)麻醉。取其頸部正中皮膚切口，切開皮下組織，正中剪開頸闊肌，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣向深部游離顯露頸總動脈。在顯微鏡下操作，剪開動脈鞘，將頸動脈與迷走神經(jīng)分離，可見病變血管壁較周圍增厚，顏色變黃，血管下墊乳膠橡皮片。動脈壁滴2滴1%的利多卡因防止痙攣，完全游離出病變段動脈并以動脈夾將其孤立，長8～12 mm，于管壁前方以尖刀作縱行切口，用纖維剪延長。肝素鹽水沖洗管腔，在切緣處用纖維鑷，纖維剝離分離出粥樣斑塊與血管中膜的界限并向管徑周圍擴展，直至與對側(cè)切緣會合，然后將整個斑塊向遠端分離，剝除斑塊遠端后，將斑塊提起向近端分離，直至取出整個斑塊，防止形成漂浮瓣。

1.3 兔頸動脈組織學及病理形態(tài)學觀察

剪取約0.5 cm頸動脈，10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。冷凍切片先用電吹風吹干，經(jīng)快速固定后水洗，蘇木素染液染色10 min。自來水沖洗5 min。0.5%鹽酸乙醇溶液分化數(shù)秒鐘。自來水沖洗。溫熱水5 min或弱堿性溶液30 s顯藍。自來水充分沖洗。伊紅復染2 min。95%乙醇和100%乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.4 兔頸動脈平滑肌原代細胞培養(yǎng)

將分離的各實驗組頸動脈壁用D-Hanks液清洗，去除表面血污，并用手術(shù)鑷去除黏附的結(jié)締組織等非所需組織。再次清洗后，用手術(shù)刀將組織切成小塊，移入青霉素小瓶中，加入適量緩沖液，用彎頭眼科剪反復剪切組織，直到組織成糊狀，約1 mm3大小。靜置片刻后用吸管吸去上層液體，加入適當?shù)木彌_液再清洗一次。將已剪切好的組織塊加入3倍的0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化3 min，靜置待組織塊沉淀后，棄去上清液，加入新鮮胰蛋白酶溶液;37℃消化10 min，收集上層消化液;加入新的酶溶液，直至組織基本消化完畢，收集的消化液立即加入Hanks液，以800 r/min，離心5 min，收集細胞沉淀，加入含20%小牛血清培養(yǎng)液少許，輕輕打散細胞沉淀，制成細胞懸液。將收集的酶-細胞懸液移入離心管，加入小牛血清至10%，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。以生長液懸浮并調(diào)細胞數(shù)至5×105/mL，靜置37℃培養(yǎng)。24 h貼壁展平。7 d后長滿瓶壁，可以進行傳代，用于檢測SOD及CAT活性。

1.5 血漿Hcy濃度測定

應(yīng)用日立7170A全自動生化分析儀(日本日立公司產(chǎn)品)測定各實驗組血漿Hcy濃度，分別計算各實驗動物5次結(jié)果的平均值，作為各實驗動物血漿Hcy濃度，并以此計算各組血漿Hcy濃度的平均值及標準差，進行統(tǒng)計學分析。

1.6 SOD活性測定

用刮刀刮下細胞，4℃下，2 000 r/min離心10 min，棄上清。用1 mL PBS清洗細胞，4℃，2 000 r/min離心10 min，棄上清。重復此步驟一次。用勻漿器將細胞破損，加入1 mL新的PBS，在冰浴器上用超聲降解細胞裂解物(60 W，0.5 s間隔，15 min)。4℃下，10 000 g離心15 min，移出上清液并用PBS稀釋，制成樣品溶液。樣品孔和空白孔2中分別加入20 μL樣品溶液，在空白孔1和空白孔3中分別加入20 mL ddH2O(雙蒸水)。每孔分別加入200μL WST工作液，混勻。空白孔2和空白孔3中分別加入20 μL Dilution buffer。樣品孔和空白孔1中分別加入20 μL酶工作液，充分混合。37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。用酶標儀在450 nm處讀數(shù)。計算SOD的活性(抑制率%)。

1.7 CAT 含量測定

將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置30 min，然后1 000 r/min離心20 min，取上清即可檢測。分別設(shè)標準孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標準孔7孔，依次加入100 μL不同濃度的標準品?？瞻卓准?00 μL蒸餾水，余孔加待測樣品100 μL，酶標板加上覆膜，37℃溫育2 h。棄去液體，甩干。每孔加檢測溶液A工作液100 μL，酶標板加上覆膜，37℃ 溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔用400 μL的洗滌液洗滌，浸泡1～2 min，甩干，重復洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。每孔加檢測溶液B工作液100 μL，加上覆膜，37℃ 溫育30 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每孔加底物溶液90 μL，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色。反應(yīng)時間25 min。每孔加終止溶液50 μL。終止反應(yīng)，此時藍色立刻轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀(中國北京科大創(chuàng)新股份有限公司)在450 nm波長測量各孔的吸光度(OD值)。根據(jù)樣品OD值，由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與值計算出標準曲線的回歸方程式，測定樣品的實際濃度。

1.8 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)資料均采用SPSS 10.0進行統(tǒng)計處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間差異采用one-way ANOVA分析檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿HCY濃度比較

各組動物飼喂8周后，每周抽取動物血漿，共5次，將5次血漿測取Hcy濃度，取5次平均值得到如下結(jié)果，見表1。

表1 實驗各組血漿Hcy濃度Tab.1 Hcy concentrations of plasma of each group(ˉx ± s) (n=8)

2.2 各組頸動脈平滑肌細胞內(nèi)CAT的含量比較

在高蛋氨酸飲食作用下，兔頸動脈平滑肌細胞內(nèi)CAT的含量明顯增高，各模型組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見表2。

表2 各實驗組CAT的含量Tab.2 CAT density of rabbit carotid artery smooth muscle cells(ˉx ± s) (n=8)

2.3 各組頸動脈平滑肌細胞內(nèi)SOD的活性比較

在高蛋氨酸飲食作用下，在較低飼喂?jié)舛阮i動脈平滑肌細胞內(nèi)SOD的活性已有所增高，在較高飼喂?jié)舛认耂OD的活性明顯增高。各蛋氨酸飲食組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表3 各實驗組SOD的活性Tab.3 The SOD activity of rabbit carotid artery smooth muscle cells in groups(±s)(n=8)

表3 各實驗組SOD的活性Tab.3 The SOD activity of rabbit carotid artery smooth muscle cells in groups(±s)(n=8)

SOD:superoxide dismutase;* P ＜0.01 vs control.

Group SOD density/(U·mL－1)Control 105.20 ±1.75 Model 1 118.42 ±1.88*Model 2 133.71 ±1.96*Model 3 148.69 ±2.06*Model 4 158.95 ±1.75*

3 討論

動脈粥樣硬化是血管內(nèi)膜形成粥樣斑塊，并引起管腔狹窄甚至閉塞的病理生理過程;內(nèi)皮細胞損傷、平滑肌細胞增生、血小板激活、凝血與纖溶系統(tǒng)失衡是其主要發(fā)病機制［3］。同型半胱氨酸是一種含硫基的4碳α-氨基酸也是一種反應(yīng)性血管損傷氨基酸。其首次由 Vigneaud Du［4］在1932年發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，在Hcy作用下，血管平滑肌細胞內(nèi)SOD和CAT的活性明顯升高。近年大量的研究［5-7］表明，血中Hcy水平升高是動脈粥樣硬化發(fā)病的一個新的獨立的危險因素。SOD和CAT為體內(nèi)活性氧的清除劑。SOD可催化 O2－，生成 H2O2，H2O2在 CAT作用下生成H2O，從而消除自由基的毒性作用。

本研究通過制備高同型半胱氨酸動物模型來模擬臨床的病理變化。制作動物模型的本身存在一定的局限性，不可能完全復制臨床病理變化。

本研究結(jié)果顯示，高蛋氨酸飼喂組VSMC細胞內(nèi)SOD的活性有明顯增加，提示一定濃度的Hcy可促使VSMC內(nèi)活性氧生成。而隨著飼喂蛋氨酸濃度的升高，SOD和CAT活性顯著增高，說明高濃度Hcy作用下活性氧增多顯著，SOD和CAT活性的增高雖可拮抗活性氧的作用，但VSMC內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)明顯，Hcy誘發(fā)VSMC出現(xiàn)了明顯的氧化損傷，這一作用可能也參與了高Hcy致動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程。

有關(guān)高同型半胱氨酸致病的機制尚不完全清楚，有資料顯示［5-7］高同型半胱氨酸是血管損傷性氨基酸，可直接造成血管內(nèi)皮細胞損傷和血管功能異常。雖然過量膽固醇沉積是造成動脈壁損傷的直接原因，但是臨床上膽固醇的水平并不能作為動脈粥樣硬化疾病的指標，這是因為膽固醇在動脈壁的堆積與多種脂蛋白，尤其是低密度脂蛋白和高密度脂蛋白有著密切的聯(lián)系。根據(jù)研究［8］，如果當體內(nèi)同型半胱氨酸代謝紊亂，濃度升高，就會形成同型半胱氨酸巰基內(nèi)酯，可與低密度脂蛋白形成復合體，隨后被巨噬細胞吞噬，形成堆積動脈粥樣硬化斑塊上的泡沫細胞。而且，同型半胱氨酸還可自發(fā)氧化，形成超氧化物和過氧化氫，這些產(chǎn)物會導致內(nèi)皮細胞的損傷和低密度脂蛋白的氧化，并可造成血管平滑肌持續(xù)性的收縮，引起缺氧，從而加速動脈粥樣硬化的過程。不僅如此，同型半胱氨酸自發(fā)形成的巰基內(nèi)酯化合物，可以和反式視黃酸共同引起血小板的凝集，與此同時，同型半胱氨酸巰基內(nèi)酯還可引起血栓素以及PGF1αR的形成。這樣就會促進血凝塊的形成，從而引起臨床上常見的梗死性疾病，這在動物實驗［9-10］中也得到了驗證。當然，同型半胱氨酸還可通過其他一些途徑誘發(fā)心血管疾病。它可誘導血管平滑肌細胞中新的mRNA的形成，使動脈壁平滑肌細胞增生，并造成動脈內(nèi)皮細胞的脫落，加速粥樣硬化的過程。另外，由于S腺苷同型半胱氨酸是依賴S腺苷蛋氨酸的甲基化反應(yīng)潛在的抑制物，所以同型半胱氨酸濃度的升高，會影響體內(nèi)許多物質(zhì)的甲基化過程，從而影響機體的正常代謝［11］。

總之，同型半胱氨酸可加速動脈血管壁平滑肌細胞粥樣硬化的進程。對于臨床高血壓、冠心病及腦血管疾病的人群，及時檢測血漿Hcy水平，有利于尋找病因，對于高同型半胱氨酸血癥的患者積極采取有效措施，通過補充維生素B12、葉酸等可降低Hcy水平，對防病治病有積極的作用。

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