他克莫司對(duì)大鼠腎缺血再灌注保護(hù)作用的研究

武 飛 劉致中

(1.烏蘭察布市中心醫(yī)院泌尿外科，烏蘭察布 012000;2.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院泌尿外科，包頭 014000)

缺血再灌注損傷是腎臟移植中不可避免的病理過程，輕者導(dǎo)致腎功能延遲恢復(fù)，重者造成腎功能衰竭，影響移植腎和患者的長期存活。如何減輕腎移植過程中的缺血再灌注損傷是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。目前雖然有多種藥物和治療手段運(yùn)用于改善腎缺血再灌注損傷，但是缺乏特異性。有研究者發(fā)現(xiàn)［1］一些新型免疫抑制藥物在使用過程中，具有改善腎缺血再灌注損傷的特性，而且能夠使損傷后的腎臟得到一定程度的修復(fù)和再生。他克莫司是目前用于器官移植后抗排異反應(yīng)的新型免疫抑制藥物。為了證實(shí)他克莫司改善腎臟缺血再灌注損傷的作用。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠缺血再灌注模型，研究他克莫司對(duì)大鼠腎缺血再灌注的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

大鼠TNF-α試劑盒(ELISA)(美國);Bcl-2蛋白單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);SP免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);他克莫司注射液(由藤澤制藥有限公司惠贈(zèng))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用健康雄性Wistar大鼠60只(購自內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量220～260 g。采用抽簽法隨機(jī)分成3組(每組20只):假手術(shù)組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。每組按再灌注時(shí)間分為4組，再灌注分別為0.5、2、6、24 h，每組5 只。

1.3 動(dòng)物模型建立

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，對(duì)大鼠注射20%烏拉坦(5 mL/kg)行腹腔麻醉后，沿腹部正中切口進(jìn)腹，切除右腎，分離左腎動(dòng)脈，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈，45 min后移走無創(chuàng)動(dòng)脈夾恢復(fù)灌注，腎臟由暗紅色變?yōu)轷r紅色，表明再灌注成功，縫合切口。假手術(shù)組僅作麻醉、開腹、行右腎切除術(shù)，并分離左腎動(dòng)脈，不阻斷腎動(dòng)脈血供，只做操作而不給藥。對(duì)照組建立腎缺血再灌注模型，于手術(shù)前6 h從尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液1 mL/kg。實(shí)驗(yàn)組建立腎缺血再灌注模型，于手術(shù)前6 h從尾靜脈注射0.2 g/L的他克莫司注射液(0.5 mg/kg)。每組在到達(dá)再灌注時(shí)間點(diǎn)分別再次麻醉，打開腹腔取血及腎臟標(biāo)本，整個(gè)手術(shù)過程均保持無菌操作。

1.4 觀察指標(biāo)

肌酣(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。將組織進(jìn)行HE染色后用光學(xué)顯微鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測(cè)血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)含量。用免疫組化技術(shù)測(cè)定腎組織Bcl-2蛋白，其陽性結(jié)果判定:Bcl－2陽性反應(yīng)結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色染色，不著色者為陰性。在高倍鏡下(400×)，每片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)為0，記作(－)，陽性細(xì)胞數(shù)25%以下為(+)，25% ～50%為(++)，51% ～75% 為(+++)，75% 以上為(++++)，并將反應(yīng)強(qiáng)度評(píng)分，“+”為1分，“++”為2分，“+++”為3分，“++++”為4分［2］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠Cr、BUN的變化

對(duì)照組大鼠在腎缺血再灌注的0.5 h、2 h、6 h及24 h，隨著再灌注時(shí)間的延長，Cr、BUN明顯升高。實(shí)驗(yàn)組大鼠在腎缺血再灌注的0.5 h、2 h及6 h，隨著再灌注時(shí)間的延長，Cr、BUN升高不明顯，而在再灌注24 h時(shí)，Cr、BUN不再升高，反而明顯降低。在腎缺血再灌注2 h、6 h和24 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的 Cr、BUN差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，詳見表1。

表1 3組大鼠各再灌注時(shí)間點(diǎn)的Cr、BUN比較Tab.1 Comparison of the Cr and BUN among three groups(±s)μmol/L

表1 3組大鼠各再灌注時(shí)間點(diǎn)的Cr、BUN比較Tab.1 Comparison of the Cr and BUN among three groups(±s)μmol/L

* P ＜0.05 vs sham operation group;△ P＜0.05 vs control group;Cr:creatinine;BUN:blood urea nitrogen.

Group Number of case Cr 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 30.50 ±5.31 33.76 ±7.12 39.44 ±7.46 43.32 ±8.61 Control group 20 50.90 ±7.09 76.08 ±4.59 98.38 ±11.43* 156.18 ±64.25*Experimental group 20 53.38 ±2.39* 60.62 ±2.88＊△ 75.10 ±17.28＊△ 51.30 ±6.47△Group Number of case BUN 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 8.76 ±1.46 10.34 ±2.2115.65 ±3.75 14.42 ±3.68 Control group 20 13.38 ±2.00 20.33 ±1.98* 26.21 ±3.28* 44.26 ±3.15 Experimental group 20 12.16 ±0.95* 14.75 ±0.63△ 19.72 ±2.44＊△ 15.29 ±3.39△

2.2 血清TNF-α 的變化

對(duì)照組在再灌注各時(shí)間點(diǎn)隨著再灌注時(shí)間的延長，TNF-α含量明顯的升高。實(shí)驗(yàn)組在再灌注0.5 h、2 h及6 h，隨著再灌注時(shí)間的延長，TNF-α含量升高不明顯，而在再灌注24 h時(shí)，TNF-α含量出現(xiàn)了降低。在再灌注的各時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組TNF-α含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，詳見表2。

2.3 免疫組化檢測(cè)腎組織Bcl-2的表達(dá)

各組大鼠腎組織中均有Bcl-2表達(dá)，主要在腎的遠(yuǎn)曲小管、近曲小管表達(dá)，但免疫反應(yīng)強(qiáng)度不同(圖1)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在再灌注2 h、6 h、24 h的Bcl-2免疫反應(yīng)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。假手術(shù)組的Bcl-2免疫反應(yīng)強(qiáng)度在2 h、6 h與實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，詳見表3。

表2 3組大鼠各再灌注時(shí)間點(diǎn)的TNF-α比較Tab.2 Comparison of the TNF-α among three groups(±s)pg/mL

表2 3組大鼠各再灌注時(shí)間點(diǎn)的TNF-α比較Tab.2 Comparison of the TNF-α among three groups(±s)pg/mL

* P ＜0.05 vs sham operation group;△ P ＜0.05 vs Control group;TNF:tumor necrosis factor.

Group Number of case 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 1.51 ±0.69 1.62 ±0.49 1.86 ±0.79 2.31 ±1.07 Control group 20 4.81 ±1.25 5.02 ±1.47 7.94 ±2.22 15.16 ±3.65 Experimental group 20 1.95 ±0.73＊△ 3.04 ±0.48＊△ 3.94 ±2.39△ 3.31 ±1.64＊△

圖1 各組大鼠腎組織缺血再灌注24 h Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.1 Bcl-2 protein expression of the kidney in ischemia reperfusion 24 h of three group(400×)A:Control group;B:experimental group;C:shame operation group.

表3 3組大鼠各再灌注時(shí)間點(diǎn)的Bcl-2反應(yīng)強(qiáng)度比較Tab.3 Comparison of the Bcl-2 among three groups(±s)

表3 3組大鼠各再灌注時(shí)間點(diǎn)的Bcl-2反應(yīng)強(qiáng)度比較Tab.3 Comparison of the Bcl-2 among three groups(±s)

* P ＜0.05 vs sham operation group;△ P ＜0.05 vs control group;Bcl:B cell lymphoma.

Group Number of case 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 3.00 ±0.71 3.60 ±0.55 2.60 ±0.55 2.20 ±0.45 Control group 20 2.20 ±0.45 1.80 ±0.45* 1.20 ±0.45* 1.40 ±0.55 Experimental group 20 2.60 ±0.55 2.60 ±0.55＊△ 2.00 ±0.00＊△ 3.20 ±0.84＊△

2.4 腎組織的病理變化

在光鏡下，對(duì)照組在再灌注各時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹、空泡變性，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，而在再灌注的6 h、24 h可見腎小管上皮細(xì)胞扁平、脫落，基底膜裸露。實(shí)驗(yàn)組在再灌注的各時(shí)間點(diǎn)，腎小管及腎小管上皮細(xì)胞病變程度較對(duì)照組明顯減輕，而假手術(shù)組未見明顯改變(圖2)。

圖2 兩組大鼠腎組織缺血再灌注24 h病理變化Fig.2 Changes of histopathology in the ischemia reperfusion 24 h of the two group(400×)

3 討論

腎臟是對(duì)缺血再灌注損傷非常敏感的器官之一，其損傷機(jī)制十分復(fù)雜，與氧自由基所致的脂質(zhì)過氧化損傷、腎血管內(nèi)皮細(xì)胞生成和釋放的舒張與收縮因子失調(diào)等因素有關(guān)［3］。目前有多種藥物和治療手段運(yùn)用于改善腎缺血再灌注損傷，他克莫司是新型免疫抑制藥物，在使用中發(fā)現(xiàn)具有改善缺血再灌注損傷的特性。他克莫司是一個(gè)鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶抑制劑，可與T細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子-鈣調(diào)蛋白依賴性磷酯酶活性蛋白結(jié)合，阻斷磷酯酶活性和鈣離子內(nèi)流，使NF-AT途徑轉(zhuǎn)錄IL-2失活，從而抑制T細(xì)胞的活化，并可通過下調(diào)FAS和上調(diào)Bcl-2使移植肝臟產(chǎn)生抗凋亡作用［4］。趙偉等［5］通過他克莫司藥液對(duì)離體腎臟的浸泡研究，發(fā)現(xiàn)通過Bcl-2蛋白、Bcl-2 mRNA的表達(dá)增加，抑制腎細(xì)胞的凋亡，對(duì)離體腎起到保護(hù)作用。有文獻(xiàn)［6］報(bào)道，他克莫司可通過減少多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1和自由基的生成;通過降低中性粒細(xì)胞的聚集和細(xì)胞黏附分子的合成來減輕缺血再灌注損傷，這種保護(hù)作用已在多種臟器中得到證實(shí)。

本文是通過活體注射他克莫司，然后建立腎缺血再灌注損傷模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bcl-2蛋白主要在腎的遠(yuǎn)曲小管、近曲小管表達(dá)，通過增加Bcl-2蛋白的表達(dá)來抑制腎細(xì)胞的凋亡，保護(hù)腎細(xì)胞缺血再灌注損傷，也證明了在腎臟組織缺血之前給予他克莫司能夠降低TNF-α的濃度，從而減輕腎臟的缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在腎臟缺血前6 h給予他克莫司藥物，行腎缺血再灌注，在再灌注的時(shí)間段里，發(fā)現(xiàn)在再灌注的24 h腎小管，腎小管上皮細(xì)胞病變程度減輕明顯，腎組織中Bcl-2表達(dá)明顯增加，腎功能明顯改善。

王東等［7］在脂肪肝供體大鼠肝移植模型中觀察到，使用他克莫司可降低移植物脂質(zhì)過氧化程度，保護(hù)肝細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，對(duì)脂肪肝供體移植物功能具有保護(hù)作用。因此根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè):在活體腎移植中，供腎者手術(shù)前6 h口服他克莫司，減輕腎缺血再灌注損傷，取出的腎植于受者，有利于受者腎功能恢復(fù)。為了移植腎術(shù)后早期功能的恢復(fù)，已有多種藥物和治療手段來減輕腎缺血再灌注損傷，因此對(duì)腎缺血再灌注損傷的防治還需更深入的研究。

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