一種靈長類動物帕金森病模型行為檢測方法

劉玉軍 魯 強(qiáng) 陳慶友 張進(jìn)祿

(首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失為主要病理特征的一種神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)主要有靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動減少和姿勢反射障礙等［1-2］。PD多在40歲以后發(fā)病，隨著老齡化日益加重，其發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯上升趨勢［3-5］。研究顯示PD發(fā)展過程中的行為改變表現(xiàn)出慢性進(jìn)展的特點(diǎn)，這與多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生慢性進(jìn)行性退變有關(guān)［1-7］。目前，有關(guān)PD模型實(shí)驗(yàn)大部分來自于嚙齒類低等動物模型，缺乏高等靈長類動物試驗(yàn)［5-8］，其原因是對高等靈長類動物PD模型行為學(xué)變化缺乏客觀有效的評價方法［9-10］。Gash D M等［10］利用計(jì)算機(jī)模-數(shù)轉(zhuǎn)換技術(shù)開發(fā)出猴運(yùn)動檢測平臺(monkey motor assessment panel 2000，mMAP2000)，此方法可以定量檢測及分析人及靈長類動物上肢運(yùn)動行為，研究結(jié)果顯示隨著年齡的增長上肢運(yùn)動的精確性降低。本課題組將上述技術(shù)應(yīng)用于靈長類(恒河猴)PD動物模型行為學(xué)定量檢測，發(fā)現(xiàn)本方法受觀察者主觀意見干擾小，是一種科學(xué)準(zhǔn)確的行為學(xué)定量方法。現(xiàn)將本方法實(shí)驗(yàn)過程簡述如下，以供借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備要求及工作原理

實(shí)驗(yàn)場地要求空間較大、無噪音、無其他人員走動、自然光充足。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)配置要求:CPU2奔騰Ⅲ500 MHz或更高;內(nèi)存128 MB或更高;硬盤空間1 GB以上可用硬盤空間;操作系統(tǒng)Windows 98、2000或XP［5］。此方法的工作原理為:實(shí)驗(yàn)籠具前方設(shè)有取食平臺，在實(shí)驗(yàn)籠具和取食平臺截面分設(shè)X和Y兩個取食口，每個取食口安裝監(jiān)控裝置，當(dāng)實(shí)驗(yàn)動物取食過程中上肢通過每個取食口時，監(jiān)控裝置通過光電二極管實(shí)現(xiàn)模-數(shù)信號轉(zhuǎn)換，并將數(shù)字信號傳輸入電腦，運(yùn)動監(jiān)控程序記錄并分析實(shí)驗(yàn)動物運(yùn)動信息(圖1)。

圖1 猴運(yùn)動檢測平臺及前臂取食實(shí)驗(yàn)的模式圖Fig.1 A diagram of the mMAP and the animal to set and view the reward in the receptacle chamber during testing

2 PD動物模型的制備

PD動物模型的制備方法同以往研究報道［7］。簡述如下:恒河猴術(shù)前禁食禁水24 h，戊巴比妥鈉25 mg/kg腹腔注射麻醉。將耳棒的尖端插入骨性外耳道口，以上頜托將上頜抬起，壓眶板壓住雙側(cè)眶下緣最低點(diǎn)確定3個平面垂直。固定后，剃去猴頭頂部毛發(fā)，碘酊消毒并鋪巾。以耳間連線前10 mm正中線右側(cè)旁開5 mm，作長約3 cm的矢狀切口。將頭皮和骨膜向兩側(cè)牽開，用顱骨鉆鉆出一直徑8 mm的骨窗，以尖針刺破硬腦膜。立體定向儀校正0點(diǎn)后，以Hamilton微量進(jìn)樣器每次抽取20 μL(2.5 g/L)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)溶液或同體積0.9%氯化鈉注射液，根據(jù)Paxinos恒河猴腦立體定位圖譜確定黑質(zhì)內(nèi)兩個靶點(diǎn)注射，第一點(diǎn)坐標(biāo)為耳間線前10.2 mm，正中線右旁開3.5 mm，硬腦膜下39 mm;第二點(diǎn)坐標(biāo)為耳間線前8.4 mm，正中線右旁開5.0 mm，硬腦膜下37 mm。每點(diǎn)注射時間為20 min，留針15 min。注射結(jié)束后，頭部傷口以3%雙氧水和慶大霉素0.9%氯化鈉注射液沖洗，縫合骨膜和頭皮，放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，慶大霉素1 mg肌肉注射，密切觀察術(shù)后動物的體溫、體質(zhì)量、飲食飲水，排泄情況。

3 上肢活動的檢測

在測試前，對動物進(jìn)行4～6周的適應(yīng)訓(xùn)練，讓其熟悉測試裝置。待動物能夠從猴上肢運(yùn)動測試儀的平臺上自由抓取食物后，進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。該測試裝置是通過多個二極管構(gòu)成的感應(yīng)器將上肢經(jīng)過不同位置的信號記錄并傳輸?shù)接?jì)算機(jī)后，運(yùn)行程序分析獲得的數(shù)據(jù)。測試時將裝置固定于觀察籠的門前，猴通過兩個直徑為8.5 cm的取食口，將放置于平臺上的食物取走(圖2)，該裝置被用于人類和猴上肢活動的定量檢測。實(shí)驗(yàn)檢測左右上肢取食活動，每側(cè)各為6次，記錄每次所需時間，取均數(shù)為每時間點(diǎn)觀察值，測試均在每日上午10點(diǎn)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過程中分別記錄手術(shù)前、手術(shù)后4周、8周、16周、24周、36周、48周猴前臂取食運(yùn)動時間和手爪抓取食物所用的時間，分別對右臂和左臂上肢活動術(shù)后各時間點(diǎn)與手術(shù)前比較采用配對t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 前臂取食實(shí)驗(yàn)圖示Fig.2 A photo showing the animal in the receptacle chamber during testing

4 疾病模型行為變化的結(jié)果分析

術(shù)后動物表現(xiàn)出右側(cè)上肢運(yùn)動無明顯變化，左側(cè)上肢運(yùn)動變得遲緩，手爪抓取食物時出現(xiàn)不穩(wěn)、吃力、靈活度下降，在術(shù)后48周時行為改變更為明顯。

4.1 前臂活動速度的改變

結(jié)果顯示，模型動物L(fēng)PS注射對側(cè)上肢(左臂)術(shù)后取食時間表現(xiàn)出不同程度的延長，隨時間的推移出現(xiàn)增加的趨勢。在術(shù)后24周，注射左側(cè)前臂取食時間與術(shù)前自身相比分別延長了30.8%;在術(shù)后36和48周，注射左側(cè)前臂取食時間分別延長了76.5%(P ＜0.01)和50%(P ＜0.01);而注射 LPS的各動物同側(cè)肢體(右臂)前臂取食時間各時間點(diǎn)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖3)。

圖3 猴前臂運(yùn)動時間Fig.3 A diagram of monkey’s forearm movement time

4.2 手爪精細(xì)活動的改變

注射LPS對側(cè)(左側(cè))手爪抓取食物所需時間延長，并出現(xiàn)抓取食物不穩(wěn)、吃力、抖動，行為改變隨著時間推移而加重。術(shù)后24周左側(cè)手爪取食時間延長了41.2%;術(shù)后36和48周，對側(cè)手爪取食時間分別延長了81.8%(P ＜0.01)和 55.6%(P ＜0.01);而各動物在注射LPS后同側(cè)(右側(cè))手爪取食時間各時間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖4 猴手爪取食運(yùn)動時間Fig.4 A diagram of the monkey’s hand movement times

5 討論

PD為多巴胺神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，肢體運(yùn)動障礙進(jìn)行性加重為臨床表現(xiàn)的神經(jīng)變性疾病［1-7］。一直以來，PD模型多以嚙齒類模型為主，嚙齒類模型的行為學(xué)檢測已經(jīng)有自主活動計(jì)數(shù)、游泳實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)等多種方法［4-6，8］。但對高等動物模型行為學(xué)評價多采用評價量表的方法，這種評價方法受觀察者主觀意見干擾影響大，很難對行為變化進(jìn)行客觀的定量評價［9-10］。本研究顯示mMAP2000系統(tǒng)可以對高等動物模型的大體運(yùn)動行為活動做定量分析，疾病模型的病程進(jìn)展過程中，出現(xiàn)上肢不同程度的運(yùn)動距離減少和運(yùn)動速度下降等行為學(xué)變化，并隨著時間的推移而逐漸加重，呈現(xiàn)進(jìn)行性呈慢性進(jìn)展的特點(diǎn)，符合帕金森病慢性進(jìn)行性加重的疾病進(jìn)展特點(diǎn)。因此，本文介紹的mMAP2000系統(tǒng)利用計(jì)算機(jī)模-數(shù)轉(zhuǎn)換技術(shù)記錄和定量分析取食過程中上肢運(yùn)動行為，可有效地去除人為因素的干擾，更加客觀反映動物上肢運(yùn)動行為的變化，是適用于大型動物(靈長類)PD模型的行為學(xué)檢測方法。

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