三種谷物的不同乙醇濃度提取物抗氧化活性研究

申迎賓，張 暉，齊希光，丁香麗，程素嬌，趙蘭濤，王 立

(江南大學(xué)食品學(xué)院科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

三種谷物的不同乙醇濃度提取物抗氧化活性研究

申迎賓，張 暉*，齊希光，丁香麗，程素嬌，趙蘭濤，王 立

(江南大學(xué)食品學(xué)院科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

以高粱、紫米、大黃米為原料，以水、60%、95%乙醇為提取介質(zhì)，對提取物的總酚含量、DPPH·清除能力和總抗氧化能力進(jìn)行了測定。同時，分析了三種谷物60%提取物對小鼠紅細(xì)胞溶血性的影響。結(jié)果表明:高粱水提物的總酚含量為2.34mg/g(GAE/DW)，分別是紫米和大黃米的4倍和12.23倍;DPPH·清除率達(dá)到43.58%，而紫米和大黃米的水提物基本無清除DPPH自由基的能力。高粱、紫米、大黃米的60%乙醇提取物的DPPH·清除能力分別為89.88%、90.16%、64.70%，高粱的總抗氧化能力為0.16mmol/g(TEAC/DW)，分別是紫米和大黃米的3.99倍和24.89倍。大黃米的95%乙醇提取物總酚含量較高，達(dá)到1.38mg/g(GAE/DW)，具有較強(qiáng)的總抗氧化能力，但DPPH·清除能力較低。高粱、紫米、大黃米在2mg/mL時對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制率分別為50.77%、16.73%、22.79%?？梢?，高粱具有一定的保護(hù)紅細(xì)胞膜的作用。

谷物，抗氧化，DPPH·，F(xiàn)RAP，溶血性

大量的流行病學(xué)研究表明，長期食用全谷物食品［1］可以降低患心血管疾病、Ⅱ型糖尿病［2］、某些癌癥(結(jié)腸癌)等慢性疾病［3］的風(fēng)險(xiǎn)。這可能是因?yàn)楣任镏懈缓攀忱w維［4］，植物化學(xué)素、礦物質(zhì)及微量元素等功能性成分。這些功能性成分相互作用或者協(xié)調(diào)作用有助于改善機(jī)體的氧化還原平衡狀態(tài)。谷物抗氧化已經(jīng)成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，谷物潛在的抗氧化能力受到越來越多的學(xué)者和專家的關(guān)注［5－8］。劉清［9］對大麥多酚進(jìn)行了研究，其在體內(nèi)外均表現(xiàn)了一定的抗氧化活性，張名位［10］對黑米進(jìn)行了研究，分析了其花色苷抗氧化活性。但目前對谷物的研究主要集中在谷物外皮方面，對整粒籽粒的谷物抗氧化能力研究較少，關(guān)于谷物對小鼠紅細(xì)胞溶血性方面的實(shí)驗(yàn)報(bào)道也較少。本文以高粱、紫米、大黃米為原料，比較了三種谷物在不同乙醇濃度提取時總酚含量、DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力，分析了三種谷物對H2O2誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用。為進(jìn)一步研究谷物的抗氧化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅高粱(sorghum) 江蘇省凌家塘農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場，產(chǎn)地:東北;紫米(violet) 黑龍江延壽縣和平糧油有限公司;大黃米(millet) 內(nèi)蒙古鵬佳米業(yè)，用粉碎機(jī)整粒磨碎，過60目，備用;昆明種小白鼠 雄性，體重(35±2)g，由上海斯萊克動物公司提供;福林酚(Folin－CiocaLteu，F(xiàn)C)試劑，2mol/L 上海荔達(dá)生物科技有限公司;1，1－二苯基－2－苦基苯肼(1，1－Diphenyl－2－picry－h(huán)ydrazyl，DPPH)、2，4，6－tri (2－pyridyl)－s－triazine(TPTZ) Sigma公司; 6－h(huán)ydroxy－2，5，7，8－tetramethylchroman－2－carboxylic acid(Trolox) Fluka Chemie AG (Buchs，Switzerland);其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

500g搖擺式高速中藥粉碎機(jī)DFY－500 浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司;SHZ－B水浴恒溫振蕩器 上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠;GZX－QF101－3S電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;722N型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;FA100精密電子天平 上海上平儀器公司;HH－S6數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;L550離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 谷物提取物的制備 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)樣品制備:分別取三種谷物1g，分別加入10mL的60%乙醇，60℃提取3h，離心，取上清，重復(fù)2次，合并提取液定容至25mL，40mg/mL(谷物質(zhì)量/體積)，待測。

溶血性實(shí)驗(yàn)樣品制備:取一定量的粉狀谷物，加入25倍體積的60%乙醇混合均勻，調(diào)節(jié)pH至3左右，于60℃下浸提3h，3000r/min離心，取上清，重復(fù)2次，將提取液于50℃減壓濃縮，經(jīng)真空冷凍干燥成粉，實(shí)驗(yàn)前用雙蒸水配制成所需濃度。

1.2.2 DPPH自由基清除率的測定［15］準(zhǔn)確稱取7.88mg DPPH，用無水乙醇溶解，定容于100mL容量瓶中，搖勻，配制濃度為2×10－4mol·L－1的溶液，保存于冰箱中，備用。向4mL 2×10－4mol·L－1DPPH·溶液中加入0.5mL樣品(空白用60%乙醇代替)，搖勻于室溫下放置30min，用無水乙醇作參比液，于517nm下測定其吸光值A(chǔ)i;同時測定4mL 2×10－4mol·L－1DPPH·溶液與0.5mL無水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)c;再測0.5mL樣品液與4mL無水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)j，根據(jù)以下公式計(jì)算樣品對DPPH·的抑制率(%)=［1－(Ai－Aj)］/Ac×100。

1.2.3 總抗氧化能力測定 FRAP(ferric reducing/ antioxidant power assay)原理［11］，為Fe3+－三吡啶三吖嗪(tripyridyl－triazine，TPTZ)可被樣品中還原物質(zhì)還原為二價(jià)鐵形式，呈現(xiàn)出藍(lán)色，并于593nm處具有最大光吸收。

FRAP試劑:0.1mol/L醋酸緩沖液(pH3.6)∶10mmol/L TPTZ(溶于40mmol/L鹽酸)∶20mmol/L三氯化鐵=10∶1∶1(V∶V∶V)。

取4mL FRAP試劑與0.1mL樣品，反應(yīng)10min后在593nm下測吸光值。以不同濃度梯度的Trolox溶液為標(biāo)樣作標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗氧化能力用TEAC(trolox equivalent antioxidant capacity)表示，空白0.1mL 60%乙醇，得到吸光值(Y)與Trolox含量(x)之間的回歸方程。

1.2.4 總酚的測定 總酚含量的測定采用Folin酚法［12］，檢測波長為765nm，取0.5mL樣品，加入0.5mL Folin酚試劑和2mL 15%的碳酸鈉溶液，充分混合，定容10mL搖勻，室溫下反應(yīng)60min，以不加碳酸鈉溶液的反應(yīng)液為空白，在特征吸收波長處測吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品總酚的相對含量。以mg/g(GAE/DW)計(jì)算。

1.2.5 抑制雙氧水誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn) 選取雄性昆明種小鼠，摘取小鼠眼球后眼眶靜脈采血，制成抗凝［13－14］血液，3000r/min離心10min分離紅細(xì)胞，吸棄上清液，用生理鹽水洗3次，最后一次加約紅細(xì)胞5倍體積的生理鹽水，3000r/min離心10min，吸棄上清，制成體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞懸液。取該懸液600μL，加入待測液600μL(對照組為加入生理鹽水600μL)，最后加400μL的200mmol/L的H202啟動氧化反應(yīng)，37℃作用1h后加6.4mL的生理鹽水，3000r/min離心10min，取上清液測定415nm處的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用微軟辦公軟件office2003，SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)均做三個重復(fù)，結(jié)果以干基表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 總酚含量

三種谷物總酚含量如圖1所示，結(jié)果表明，各谷物水提物總酚含量大小順序:高粱＞紫米＞大黃米，高粱最高，為2.34mg/g(GAE/DW)，分別是紫米和大黃米的4倍和12.23倍。各谷物60%乙醇提取物總酚含量大小順序?yàn)?高粱＞紫米＞大黃米。各谷物95%乙醇提取物總酚含量大小順序?yàn)?高粱＞大黃米＞紫米。紫米60%乙醇提取物的總酚含量較水提物有所提高，達(dá)到1.18mg/g(GAE/DW)。大黃米在95%乙醇濃度下，總酚含量最高，達(dá)到1.38mg/g(GAE/DW)。

圖1 不同乙醇濃度對谷物總酚含量的影響Fig.1 Effect of different ethanol extraction on TPC of grains

2.2 DPPH·清除能力

三種谷物清除DPPH自由基能力如圖2，結(jié)果表明，各谷物的水提取物DPPH清除能力較低，高粱水提物的DPPH清除率達(dá)到43.58%，而紫米和大黃米基本無清除DPPH自由基的能力。用60%乙醇提取時，高粱、紫米、大黃米均顯示了最高的DPPH自由基清除能力，清除率分別達(dá)到為:89.88%、90.16%、64.70%。用95%乙醇提取時，高粱的DPPH清除能力仍然最強(qiáng)，而紫米和大黃米清除率較低。同時，相關(guān)性分析結(jié)果表明，總酚與DPPH清除率呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.595，p=0.09＞0.05)，但未到到顯著水平。

圖2 不同乙醇濃度對三種谷物清除DPPH·能力的影響Fig.2 Effect of different ethanol extraction on DPPH of grains

2.3 總抗氧化能力

三種谷物總抗氧化能力如圖3所示，結(jié)果表明，三者的水提物均有總抗氧化能力。用60%乙醇提取時，高粱顯示了最高的總抗氧化能力為0.16mmol/g (TEAC/DW)，分別是紫米和大黃米的 3.99倍和24.89倍。用95%乙醇提取時，高粱等抗氧化能力仍為最強(qiáng)。大黃米的水提物總抗氧化能力為0.07mmol/g (TEAC/DW)，表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗氧化能力。同時，相關(guān)性分析結(jié)果表明，總酚含量與總抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)(r=0.832，p=0.005＜0.01)。

圖3 不同乙醇濃度對三種谷物總抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of different ethanol extraction on total antioxidant capacity of grains

2.4 不同谷物對紅細(xì)胞溶血性的影響

紅細(xì)胞具有典型的生物體細(xì)胞膜［16］結(jié)構(gòu)，作為一種容易得到的生物材料被廣泛應(yīng)用于膜脂質(zhì)過氧化的研究中。在生物體內(nèi)，紅細(xì)胞處于充足的氧環(huán)境中，含有啟動和催化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的金屬絡(luò)合物血紅蛋白，且紅細(xì)胞膜上富含多價(jià)不飽和脂肪酸，這些特點(diǎn)均使該類細(xì)胞對氧化損傷極為敏感，紅細(xì)胞在生物體內(nèi)不僅會發(fā)生部分發(fā)生自氧化解體，體外的溫浴過程及自由基誘導(dǎo)劑同樣會使其發(fā)生氧化溶血，產(chǎn)生大量的自由基。因而考察抗氧化劑對紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響被公認(rèn)為是研究細(xì)胞氧化損傷的重要方法之一。

2.4.1 高粱對紅細(xì)胞溶血性的影響 高粱對溶血性的影響見表1，結(jié)果表明，較高濃度的高粱提取物對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血具有顯著的抑制作用(p＜0.05)，隨著提取物濃度的增強(qiáng)，抑制能力越強(qiáng)。高粱在2mg/mL時，抑制率為50.77%?？梢姼吡粚2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血有一定的抑制作用，在一定程度上保護(hù)紅細(xì)胞膜。但是溶血率明顯高于對照組，說明H2O2使紅細(xì)胞膜受氧化而損傷，細(xì)胞內(nèi)容物外流。

表1 高粱60%乙醇提取物對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用Table 1 Inhibition of 60%ethanol extraction of sorghum rice on red blood cell hemolysis induced by H2O2

2.4.2 紫米對紅細(xì)胞溶血性的影響 紫米對溶血性的影響見表2，結(jié)果表明，高濃度紫米提取物對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血抑制作用效果不強(qiáng)。但是隨著紫米提取物濃度增加，其抑制率變大。紫米在最高濃度2mg/mL時，抑制率為16.73%，較高粱低。不能很好地保護(hù)紅細(xì)胞膜，導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)容物外流。

表2 紫米60%乙醇提取物對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用Table 2 Inhibition of 60%ethanol extraction of purple rice on red blood cell hemolysis induced by H2O2

2.4.3 大黃米對紅細(xì)胞溶血性的影響 大黃米對溶血性的影響見表3，結(jié)果表明，高濃度大黃米提取物對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血抑制作用效果不強(qiáng)。但是隨著大黃米提取物濃度增加，其抑制率變大，這與高粱、紫米的變化趨勢類似。大黃米在最高濃度2mg/mL時，抑制率為22.79%。不能很好地保護(hù)紅細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物外流。

表3 大黃米60%乙醇提取物對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用Table 3 Inhibition of 60%ethanol extraction of rhubarb rice on red blood cell hemolysis induced by H2O2

3 結(jié)論

3.1 各谷物水提物總酚含量大小順序:高粱＞紫米＞大黃米，高粱最高，為2.34mg/g(GAE/DW)分別是紫米和大黃米的4倍和12.23倍。各谷物的水提取物DPPH·清除能力較低，高粱水提物的DPPH·清除率達(dá)到43.58%，而紫米和大黃米基本無清除DPPH自由基的能力。

3.2 紫米60%乙醇提取物的總酚含量較水提物有所提高達(dá)到1.18mg/g(GAE/DW)。大黃米的95%乙醇濃度下，總酚含量最高，達(dá)到 1.38mg/g(GAE/ DW)。

3.3 用60%乙醇提取時，高粱、紫米、大黃米均顯示了最高的DPPH自由基清除能力，清除率分別達(dá)到89.88%、90.16%、64.70%。此時，高粱顯示了最高的總抗氧化能力為0.16mmol/g(TEAC/DW)，分別是紫米和大黃米的3.99倍和24.89倍。

3.4 三種谷物提取物都是隨著濃度增加而其對紅細(xì)胞氧化溶血的抑制率變大，但是在相同濃度下，高粱均高于紫米和大黃米。高粱、紫米、大黃米在2mg/mL時，抑制率分別為50.77%、16.73%、22.79%。高粱有一定的保護(hù)細(xì)胞膜作用，抑制細(xì)胞內(nèi)容物的溶出，而紫米和大黃米起不到保護(hù)細(xì)胞膜的作用。

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Antioxidant capacity of different ethanol extraction from three grains

SHEN Ying－bin，ZHANG Hui*，QI Xi－guang，DING Xiang－li，CHENG Su－jiao，ZHAO Lan－tao，WANG Li
(China State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The antioxidant capacity of different ethanol extraction from three grains(sorghum，purple rice，rhubarb rice)were evaluated.During the experiment，total phenols，DPPH·scavenging ability and total antioxidant capacity were measured with the water，60%，95%ethanol extractions of the three grains.Meanwhile，the mice blood cells hemolytic effect of 60%ethanol extracts of three grains was evaluated in vitro.The results showed that the total phenol content of sorghum water extraction was 2.34mg/g(GAE/DW)，which was 4 times the content of purple rice and 12.23 times that of rhubarb rice，respectively.DPPH·scavenging ability of sorghum water extraction was 43.58%，however，DPPH·scavenging ability for the water extraction of purple rice and rhubarb rice was very low.In 60%ethanol concentration，the DPPH· scavenging ability of three grains were 89.88%，90.16%and 64.70%，respectively.The total antioxidant capacity，0.16mmol/g(TEAC/DW)，was 3.99 times and 24.89 times that of purple rice and rhubarb rice.The total phenol content of 95%ethanol extraction of rhubarb rice was 1.38mg/g(GAE/ DW)，total antioxidant capacity was strong，but the DPPH· scavenging ability was low.The inhibition rates of hemolytic effect of three grains were 50.77%，16.73%and 22.79%respectively at 2mg/mL.The results showed that sorghum could protect blood cells membrane modestly.

grain;antioxidant;DPPH·;FRAP;hemolytic

TS202.1

A

1002－0306(2012)21－0146－04

2012－03－28 *通訊聯(lián)系人

申迎賓(1981－)，男，博士研究生，主要從事糧食深加工及資源利用研究。