GC法測(cè)定羥乙基淀粉摩爾取代度的研究

杜中海，任傳杰，于 鵬，宋彥會(huì)，袁洪雨

(山東齊都藥業(yè)有限公司，山東淄博255400)

羥乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)為淀粉在酸性條件下水解成一定分子量后，在堿性條件下羥乙基化而成，即位于葡萄糖基上的羥基被羥乙基取代，取代后的淀粉不易被體內(nèi)的淀粉酶水解，可維持較長(zhǎng)時(shí)間的滲透壓。一般而言，HES的擴(kuò)容強(qiáng)度主要決定于體內(nèi)分子量大小。體內(nèi)停留時(shí)間則主要由HES的羥乙基化程度大小決定。低分子量HES擴(kuò)容強(qiáng)度小，而高取代級(jí)HES因體內(nèi)停留時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)發(fā)生凝血機(jī)制受損和體內(nèi)蓄積［1］。目前，國(guó)內(nèi)多采用摩根法測(cè)定羥乙基淀粉取代度，存在操作繁瑣、檢測(cè)誤差大等問題。本文研究了GC法測(cè)定羥乙基淀粉摩爾取代度的反應(yīng)條件、雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，并與摩根法進(jìn)行了比較。

1 儀器與試藥

Agilent 7890A氣相色譜儀，羥乙基淀粉標(biāo)準(zhǔn)品(歐洲藥典委員會(huì)，Code:Y0001277)，羥乙基淀粉130/0.4(山東齊都藥業(yè)有限公司，批號(hào):110601)，碘乙烷、甲苯、氫碘酸等其他試劑均為色譜級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:DB－624石英毛細(xì)管柱(L=60 m，?=0.53 mm);固定相:6%氰丙基苯基聚甲基硅氧烷(膜厚3 μm);進(jìn)樣口溫度200℃;程序升溫:50℃維持4 min，以15℃·min－1升至230℃維持4 min;載氣:氮?dú)?流速:8 mL·min－1;進(jìn)樣體積:1 μL;分流比:1∶20;FID 檢測(cè)器;檢測(cè)器溫度280℃;定量方法:內(nèi)標(biāo)法;內(nèi)標(biāo)物:甲苯;洗脫順序:碘乙烷，甲苯。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 內(nèi)標(biāo)溶液的制備:精密吸取甲苯1.0 mL，用二甲苯稀釋至 200.0 mL，即得。

羥乙基淀粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:取羥乙基淀粉標(biāo)準(zhǔn)品約50 mg精密稱定，置反應(yīng)瓶中，加入0.10～0.15 g己二酸，精密加入1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液和2.0 mL氫碘酸，密封。135℃下反應(yīng)15 h，冷卻至室溫，精密稱定，去掉失重超過5 mg的樣品，分別吸取上清液100 μL，置進(jìn)樣瓶中，用1.0 mL鄰二甲苯稀釋，密封，搖勻，取1 μL注入氣相色譜儀，測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 羥乙基淀粉標(biāo)準(zhǔn)品GC色譜圖

碘乙烷峰在6.28 min，甲苯峰在 9.294 min，無其他雜峰干擾，分離度良好。

2.3 線性關(guān)系考察 向7個(gè)反應(yīng)瓶中分別加入己二酸約0.10 ～0.15 g，1.0 mL 內(nèi)標(biāo)溶液和 2.0 mL 氫碘酸，密封。用100 μL的定量進(jìn)樣器分別精密加入約 10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg 碘乙烷，密封。精密量取反應(yīng)后的對(duì)照溶液各1 μL注入氣相色譜儀，以碘乙烷的質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，碘乙烷與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

圖2 對(duì)照品碘乙烷線性圖譜

線性方程為Y=0.027 5X－0.002 2，線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 9。由線性試驗(yàn)可知，碘乙烷濃度在 0.30～2.1 mg·mL－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

2.4.1 GC法測(cè)定羥基淀粉取代度 取供試品溶液，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，重復(fù)6次試驗(yàn)，記錄色譜圖，計(jì)算取代度，結(jié)果見表1。

表1 GC法精密度考察表

2.4.2 摩根法測(cè)定羥乙基淀粉取代度 摩根法檢測(cè)羥乙基淀粉取代度是將羥乙基淀粉經(jīng)氫碘酸水解，羥乙基轉(zhuǎn)化成碘乙烷和乙烯，然后分別將二者轉(zhuǎn)化成碘，進(jìn)行氧化還原滴定［2］。重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果見表2。

表2 摩根法精密度考察表

比較上述兩種方法可知:GC法檢測(cè)羥乙基淀粉取代度準(zhǔn)確度高，精密度好，而且一次可同時(shí)處理多份樣品，色譜條件耐用性較強(qiáng)，對(duì)色譜柱要求不高。摩根法裝置復(fù)雜，操作過程繁瑣，且不能同時(shí)處理多批次樣品，其測(cè)定誤差主要來自于反應(yīng)的完全程度及氣體泄漏。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 依法制備對(duì)照品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8 h，精密量取 1 μL 注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算取代度，結(jié)果見表3。

表3 溶液穩(wěn)定性考察表

由穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可知，溶液在室溫放置8 h內(nèi)，穩(wěn)定性良好。

2.6 樣品反應(yīng)條件試驗(yàn)

2.6.1 依法制備供試品分別于 135 ℃加熱 10、11、12、13、14、15、16、17 h，放冷至室溫，精密稱重，去掉失重超過 5 mg的樣品，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)取代度的影響

2.6.2 依法制備供試品分別于120℃、125℃、130℃、135℃、140 ℃、145 ℃、150 ℃、155 ℃ 下加熱 15 h［1］，放冷至室溫，精密稱重，去掉失重超過5 mg的樣品，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖4。

反應(yīng)溫度低或時(shí)間短時(shí)，反應(yīng)不徹底，檢測(cè)結(jié)果偏低;溫度過高或反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，反應(yīng)瓶的氣密性很難保證。最佳反應(yīng)溫度為135℃，15 h。

2.7 樣品含水量及含鹽量的影響 將羥乙基淀粉130/0.4樣品暴露吸水后，比較同一取代度不同水分含量測(cè)定結(jié)果。向羥乙基淀粉130/0.4樣品中加入一定量氯化鈉，比較同一取代度不同氯化鈉含量測(cè)定結(jié)果［1］，結(jié)果見表4。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響

表4 樣品含水量及含鹽量對(duì)取代度的影響

結(jié)論:樣品中水分含量在2% ～4%，氯化鈉含量在0.5%～15%，在計(jì)算過程中扣除水分及氯化鈉，對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。

3 討論

GC法測(cè)定羥乙基淀粉摩爾取代度的反應(yīng)條件研究中，考察了反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果表明反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果有明顯影響，最佳反應(yīng)條件為135℃反應(yīng)15 h。

在不同檢測(cè)方法測(cè)定取代度的研究中，考察了GC法與摩根法的精密度，結(jié)果表明GC法測(cè)定的精確度要高于摩根法。在雜質(zhì)影響的研究中，考察了不同水分含量與氯化鈉含量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明水分在2%～4%，氯化鈉在0.5% ～15%對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。通過進(jìn)行檢測(cè)方法的方法學(xué)試驗(yàn)，表明GC法簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確度高，可作為羥乙基淀粉摩爾取代度的檢測(cè)方法。

［1］Lee YC，Baaske DM，Carter JE.Determination of the molar substitution ratio of hydroxyethyl starches by gas chromatography［J］.Anal Chem，1983，55(2):334 －338.

［2］Johanson G.Analysis of ethylene glycol ether metabolites in urine by extractive alkylation and electron－capture gas chromatography［J］.Arch Toxicol，1989，63(2):107 －111.